научная статья по теме АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПРОМОТОРЫ, ЛОКАЛИЗОВАННЫЕ В ИНТРОНАХ ГЕНА SGMS1, УЧАСТВУЮТ В РЕГУЛЯЦИИ ЕГО ЭКСПРЕССИИ В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПРОМОТОРЫ, ЛОКАЛИЗОВАННЫЕ В ИНТРОНАХ ГЕНА SGMS1, УЧАСТВУЮТ В РЕГУЛЯЦИИ ЕГО ЭКСПРЕССИИ В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 2, с. 325-333

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.21

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПРОМОТОРЫ, ЛОКАЛИЗОВАННЫЕ В ИНТРОНАХ ГЕНА SGMS1, УЧАСТВУЮТ В РЕГУЛЯЦИИ ЕГО ЭКСПРЕССИИ В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА

© 2015 г. А. В. Рожкова1, §, И. Б. Филиппенков1, §, О. Ю. Сударкина1, С. А. Лимборская1, 2, Л. В. Дергунова1,2*

1 Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 2Научно-исследовательский институт цереброваскулярной патологии и инсульта Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения РФ,

Москва, 117997 Поступила в редакцию 18.07.2014 г. Принята к печати 25.08.2014 г.

Сфингомиелинсинтаза 1 (8М81) — жизненно важный фермент, обеспечивающий синтез сфингомиелина и диацилглицерина из фосфатидилхолина и церамида в эукариотических клетках. Ранее мы детально исследовали структуру гена SGMS1 человека и идентифицировали множество его транскриптов. Обнаружены изоформы мРНК, отличающиеся по участку в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) и кодирующие полноразмерный белок, а также транскрипты, которые возникают в результате альтернативной комбинации экзонов и включают кодирующую область гена и 3'-НТО. По данным компьютерного анализа, синтез транскриптов, отличающихся по 5'-НТО, начинается с разных промоторов гена SGMS1. Используя метод ПЦР в реальном времени, мы показали, что содержание пяти вариантов альтернативных транскриптов данного гена, отличающихся по 5'-НТО, в исследованных нами тканях человека существенно различается. Наиболее велико содержание транскриптов, которые синтезируются под контролем дистального промотора, включающего экзон 1. Меньше количество транскриптов, включающих 5'-концевые экзоны, синтез которых обеспечивают промоторы, локализованные в интронах данного гена. Разный уровень содержания транскриптов гена SGMS1, отличающихся по 5'-НТО, свидетельствует о том, что использование тех или иных альтернативных промоторов тканеспецифично и, по-видимому, подвержено регуляции. Структура 5'-НТО транскриптов гена SGMS1, направляемых альтернативными промоторами, существенно различается, что свидетельствует о регуляции функционирования гена на посттранскрипционном уровне

Ключевые слова: сфингомиелинсинтаза 1 человека, альтернативные промоторы, 5'-НТО, экспрессия гена, уровень транскриптов, ПЦР в реальном времени.

ALTERNATIVE PROMOTERS LOCALISED IN SGMS1 GENE INTRONS TAKE PART IN REGULATION OF ITS EXPRESSION IN HUMAN TISSUES, by A. V. Rozhkova1, I. B. Filippenkov1, O. Yu. Sudarkina1, S. A. Limborska1'2, L. V. Dergunova1'2* ^Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 123182 Russia; 2Research Institute of Cerebrovascular Pathology and Stroke, Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, 117997 Russia; *e-mail: lvdergunova@mail.ru). Sphingomyelin synthase 1 (SMS1) is an enzyme of vital importance which is responsible for the synthesis of sphingomyelin and diacylglycerol from phosphatidylcholine and ceramide in eukaryotic cells. Previously we have investigated in detail the structure of SGMS1 human gene and identified a lot of its transcripts. We revealed the isoforms of mRNA differing in the 5'-UTR and coding the full-length protein, and also the transcripts arising from alternative combination of the exons localized in the coding region of the gene and 3'-UTR. From the results of computer analysis it follows that the synthesis of transcripts differing in the 5'-UTR is enabled by the different promoters of SGMS1 gene. It has been found in the present work by the method of real-time PCR that the content of five alternative transcripts of this gene, differing in the 5'-UTR, is substantially dissimilar among human tissues. In all the investigated tissues those transcripts are presented most prominently whose synthesis takes place under the control of the distal promoter including exon 1. In lesser extent are presented the transcripts including 5'-end exons whose synthesis is enabled by the promoters localized in introns of this gene. The differential level of content of SGMS1 gene transcripts, differing in the 5'-UTR, indicates that the use of the alternative promoters is

§ Авторы внесли равный вклад при подготовке работы.

* Эл. почта: lvdergunova@mail.ru

tissue-specific and apparently strictly regulated. The structural organization of 5'-UTR variants of SGMS1 transcripts, directed by alternative promoters, is substantially different; this can provide regulation of the gene functioning on post-transcriptional level.

Keywords: human sphingomyelin synthase 1, alternative promoters, 5'-UTR, gene expression, transcription level, real-time PCR.

DOI: 10.7868/S0026898415010152

В настоящее время изучены некоторые механизмы, обеспечивающие многообразие транскрип-тов, кодируемых одним и тем же геном. Анализ транскриптома человека показал, что около 70% генов подвергается альтернативному сплайсингу [1], 60% — альтернативному полиаденилированию [2]; при транскрипции множества генов (81%) используются альтернативные сайты инициации [3] и альтернативные промоторы (52% ) [4]. Таким образом, большая часть генов человека синтезирует транскрипты, являющиеся результатом одного или комбинации нескольких механизмов регуляции транскрипции. К числу генов, на которых синтезируется множество альтернативных транскрип-тов, относится ген, кодирующий сфингомиелин-синтазу 1 (SMS1). Эта ферментативная активность в эукариотических клетках обнаружена гораздо раньше, чем был описан сам белок, катализирующий синтез сфингомиелина и диацилглицерина из фосфатидилхолина и церамида. Структуру гена SGMS1 определили раньше, чем аминокислотную последовательность фермента [5—8]. Обнаруженный нами ген, названный МОВ, включающий последовательность из клонотеки кДНК продолговатого мозга (medulla oblongata), получил номенклатурное название TMEM23. Он располагается на 10-ой хромосоме человека в области 10q11.2, включает 11 экзонов и кодирует гипотетический пептид из 413 аминокислот, последовательность которого полностью совпадает с последовательностью описанного позже белка SMS1 [9, 10].

Было показано, что SMS1 участвует в регуляции многих жизненно важных процессов: в регуляции везикулярного транспорта белковых молекул, в клеточной пролиферации, апоптозе, метаболизме холестерина, некоторых аполипопротеинов, и в других [11—14]. Многообразие и сложность биологических процессов с участием фермента SMS1 предполагает специфичность контроля экспрессии соответствующего гена в отдельных клетках и тканях организма, однако до сих пор особенности регуляции экспрессии гена SGMS1 изучены недостаточно. Нами обнаружен транскрипт данного гена (Acc. no. BN000143 GenBank), который имеет длину 3734 п.н.; его 5'-нетранслируемая область (5'-НТО) включает экзоны 1—6 и участок экзона 7; кодирующая область локализуется в экзонах 7—10 и в участке экзона 11, а 3'-НТО — целиком при-

надлежит оставшейся части экзона 11 [7]. При комбинации данных in silico и экспериментальных данных с использованием метода ОТ-ПЦР нам удалось обнаружить альтернативные транскрипты, отличающиеся по участку 5'-НТО и кодирующие полноразмерный белок, а также укороченные изоформы мРНК SGMS1, возникающие, по-видимому, в результате тканеспецифического интронного полиаденилирования [15, 16].

В данной работе, при помощи метода ПЦР в реальном времени, в разных тканях человека исследованы транскрипты гена SGMS1, отличающиеся по 5'-НТО и кодирующие полноценный белок. Кодирующая область этих транскриптов совпадает с кодирующей областью транскриптов гена, начинающихся с экзона 1. Он обеспечивает синтез фермента СМС1, обладающего сфинго-миелинсинтазной активностью. Выше упомянуты работы [9, 10] двух групп авторов, показавших синтез белка данной кодирующей областью. Обсуждается участие альтернативных промоторных областей гена SGMS1 в механизме тканеспецифи-ческой регуляции экспрессии этого гена.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение РНК и синтез кДНК. Суммарную РНК из постмортальных тканей, а также из крови и плаценты человека выделяли с помощью реагента TRIzol ("Invitrogen", США) согласно рекомендациям производителя. РНК обрабатывали ДНКазой I (MBI "Fermentas", Латвия) в присутствии ингибитора РНКаз согласно протоколу, рекомендованному производителем, и депротеинизиро-вали смесью фенола и хлороформа (1 : 1). Целостность препаратов РНК проверяли путем электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Отсутствие в препаратах кДНК примеси геномной ДНК подтверждается с помощью ПЦР, с использованием в качестве матрицы РНК и праймеров, специфичных к последовательности экзона 7d (результаты не представлены).

Синтез кДНК проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 5 мкг РНК, с использованием набора реактивов RevertAid First Strand cDNA Synthesis и коротких олигодезокси-рибонуклеотидных случайных праймеров (MBI

"Fermentas") в соответствии с рекомендациями производителя.

Нозерн-блот анализ. 12 мкг суммарной РНК ткани, обработанной ДНКазой I, разделяли в денатурирующем 1.3%-ном агарозном геле, содержащем 40 мМ буфер MOPS, pH 7.0, 10 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА и 2.2 М формальдегид, как описано ранее [17], и переносили на мембрану Hy-bond N+ (GE "Healthcare", США) путем нисходящего щелочного капиллярного переноса [18].

Для получения радиоактивного зонда кДНК лобной коры амплифицировали в присутствии праймеров F (5'-GGCGTAGACATCCCCACC-3') и R (5'-TACAGCGTGCCAACTATGC-3'), специфичных к последовательности экзонов 7 и 8 гена SGMS1 соответственно. Фрагмент кДНК длиной 407 н., содержащий 362 н. 3'-концевой области экзона 7 и 45 н. 5'-концевой области экзона 8, выделяли из геля, очищали и использовали для получения зонда путем асимметричной амплификации с R-праймером. В реакционных смесях объемом 20 мкл содержалось 20 нг матрицы, 150 нМ R-праймера, 0.1 мМ каждого из трех нук-леотидов dGTP, dCTP и dTTP, 2 мкМ dATP, 2мкМ (a-32P)-dATP (5 M Bq), 1.5 мМ MgCl2, 1 ед. смеси ДНК-полимераз (High Fidelity PCR Enzyme Mix, "Thermo Scientific", США) и буфер, поставляемый фирмой с

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»