ГЕНЕТИКА, 2006, том 42, № 2, с. 159-168
ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^
МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 575:579.841.11:579.842.11
АМБИВАЛЕНТНЫЕ БАКТЕРИОФАГИ РАЗНЫХ ВИДОВ, АКТИВНЫЕ НА ШТАММАХ Escherichia coli K12 И Salmonella sp.
© 2006 г. В. Н. Крылов1, С. Миллер2, Р. Рахел3, М. Библ2, Е. А. Плетенева1, M. Шуетц2, С. В. Крылов1, О. В. Шабурова1
1 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545; e- mail: krylov@genetika.ru 2 Profos AG, Regensburg, Germany; e-mail: stefan.miller@profos.de 3 University of Regensburg, Germany; e-mail: reinhard.rachel@biologie.uni-r.de Поступила в редакцию 16.06.2005 г.
Исследовано несколько бактериофагов разных видов (в том числе фаги U2 и LB, родственные Т-чет-ным фагам E. coli), способных расти на штамме Escherichia coli K12 и на некоторых штаммах Salmonella (мы обозначаем эти бактериофаги как "амбивалентные"). Т-четные амбивалентные фаги (U2 и LB) встречаются крайне редко и при этом, как оказалось, имеют очень ограниченное число хозяев среди штаммов Salmonella . U2 и LB проявляют сходство с каноническими Т-четными фагами, специфичными для E. coli по морфотипу и размерам фаговой частицы и по реакции со специфической анти-Т4-сывороткой. Количество и размер структурных белков у фагови2 и LB идентичны, причем некоторые из этих белков сходны по размеру со структурными белками фагов Т4 и T2. Рестрикци-онные профили ДНК фагов U2 и LB отличаются друг от друга и от профилей ДНК фагов T2 и T4, но при этом ДНК всех четырех упомянутых фагов проявляют значительный уровень гомологии. Довольно неожиданно оказалось, что фаги U2 и LB, будучи выращены на их хозяине Salmonella bon-gori, проявляют нестабильность фаговых частиц в ходе центрифугирования в градиентах плотности хлористого цезия. Были также обнаружены амбивалентные бактериофаги и нескольких иных, нежели Т-четные, видов, сходные по морфотипу с лямбдоидными или иными фагами кишечной палочки. Один из амбивалентных фагов имеет высокое сходство с известным фагом Felix01, специфичным только для Salmonella. Такие амбивалентные фаги могут быть полезны для развития в будущем нового набора фагов для фаготипирования Salmonella. Очевидное их преимущество для этой цели состоит в том, что если их получать на лабораторном штамме E. coli K12, который не образует активных умеренных фагов, то препараты типирующих фагов не будут представлять собой смеси с умеренными фагами, часто встречающимися у разных штаммов Salmonella. Присутствие в препарате типирующего фага умеренных фагов может давать ложные положительные результаты в ходе идентификации специфических штаммов Salmonella, выделенных из внешней среды или в ходе вспышек сальмонеллезных инфекций. Описанные амбивалентные фаги могут быть также полезными при использовании как в фаготерапии, так и в профилактике сальмонеллезов у людей и животных.
В результате развития сравнительной геноми-ки было обнаружено несколько супергрупп бактериофагов. Такая типичная супергруппа включает в себя виды фагов, которые используют в качестве хозяев бактерии разных таксонов, не имеют гомологии ДНК (или имеют очень слабую гомологию), но обнаруживают при этом общие фундаментальные признаки, такие как организация генома, стратегия развития, морфология и (обычно) размеры фаговых частиц. Не обладая гомологией, геномы таких фагов содержат гены, кодирующие белки со значительным сходством в последовательности аминокислот. Примером таких признанных супергрупп являются фаги, родственные Т-четным фагам [1], Т7-родственные [2-4], лямбдоиды [5-9], Р22- [10-13], фК2-родст-венные [14-18]. Но встречаются и пока необъяснимые "белые пятна". Например, фаги Т-четной супергруппы были обнаружены для разных групп бактерий, неродственных E. coli [1], но до сих пор
не было описано Т-четных фагов, растущих на бактериях видов Salmonella. Это довольно странно, если принять во внимание близкое родство родов Escherichia и Salmonella, образующих в скрещиваниях in vivo жизнеспособные гибриды [19].
Другой пример: фаг Felix01, имеющий большой геном и относящийся к Myoviridae, растущий на многих штаммах Salmonella, не проявляющий генетического родства с Т-четными фагами [20] (другие структурные белки, размер генома, мор-фотип), хотя и напоминающий Т-четные фаги наличием системы подавления лизиса при реинфек-ции и образованием мутантов быстрого лизиса) [21], был описан только для Salmonella, но не для кишечной палочки.
Приведенные случаи вряд ли можно объяснить тем, что бактерии не могут осуществлять экспрессию геномов этих фагов. Действительно, геном канонического фага Т4 может экспресси-роваться по меньшей мере в некоторых штаммах
Salmonella [22], если его ввести в клетки способом, исключающим процесс нормальной адсорбции/инъекции. По-видимому, именно эта стадия и блокирована в системе T4/Salmonella. Описаны некоторые новые Т-четные бактериофаги E. coli, которые используют нетрадиционные рецепторы бактерий для адсорбции/инъекции [23]. Исходя из этого мы предположили, что могут существовать истинные Т-четные фаги, способные расти на бактериях Salmonella, и провели их поиск. В данной работе мы описываем результаты поиска амбивалентных фагов: выделение двух разных Т-четных фагов, названных U2 и LB, которые могут расти на лабораторных штаммах E. coli K12, E. coli В и на некоторых штаммах Salmonella. Такие амбивалентные фаги были также описаны для других видов фагов (например, родственных фагу Felix01).
Изучение T-четных амбивалентных фагов обнаружило интересный признак: они оказались структурно нестабильными в процессе очистки и концентрации в стандартных условиях центрифугирования в градиенте хлористого цезия.
Выделение амбивалентных фагов, принадлежащих к разным видам, и тот факт, что они обладают разной специфичностью роста в отношении штаммов Salmonella, могут стать вкладом в создание новой системы фаготипирования, лишенной недостатка принятой сейчас системы (невозможности реконструировать типирующие фаги из-за их рекомбинации в ходе размножения с резидентными профагами) [24-26] и пригодной для мониторинга штаммов Salmonella sp. Изучение амбивалентных фагов может способствовать также пониманию их возможной роли в эволюции, в том числе в предполагаемом процессе "тасования генов" фагов разных видов бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериофаги. Большинство новых амбивалентных бактериофагов выделено из разных образцов сточных вод. Бактериофаг 479X1 выделен из коммерческого препарата смеси фагов производства фабрики в Хабаровске (Россия). Амбивалентные бактериофаги, приведенные в табл. 4 и обозначенные 1, 2, 4, 10/1, 10/2, 11, 12, 14, являются родственными бактериофагу B1 (рис. 1). Бактериофаги T2 и T4 , а также анти-Т4-сыворотка были любезно предоставлены д-ром H.H. Сыкилиндой (Институт биоорганической химии им. М.Ф. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва).
Бактериальные штаммы. Лабораторные штаммы E. coli K12 и E. coli B были любезно предоставлены профессором В.В. Месянжиновым (Институт биоорганической химии им. М.Ф. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва). Более 40 штаммов Salmonella enterica, представляю-
щих разные подвиды и серотипы, и Salmonella bongori ( получены из Института им. Коха, Берлин) использовались в работе для сравнения спектра роста фагов (табл. 1).
Среды - LB и LA [27].
Фаговые препараты были получены методом сливного лизиса, затем концентрированы и очищены центрифугированием в преформированном ступенчатом градиенте хлористого цезия [27].
Измерение уровня адсорбции - по оценке неад-сорбированного фага хлороформным методом [27].
Реакция с анти-Т4-сывороткой - как в [27].
Электронная микроскопия. Образцы наносили на покрытые углеродом прокаленные медные сеточки, отмывали дистиллированной водой в течение 3 с и негативно окрашивали 2%-ным уранил-ацетатом. Электронные микрографии были сделаны на электронном микроскопе CM12 (FEI, Eindhoven, Нидерланды), при 120 keV, с использованием медленно сканирующей камеры CCD (TVIPS, Gauting, Германия).
Работа с ДНК. Выделение, обработка эндо-нуклеазами, гибридизация - в соответствии с методами в [27].
Электрофорез структурных белков - как в [27].
ПЦР и сравнение гена главного хвостового белка фага Felix01 и нового амбивалентного фага 479X1. ПЦР осуществляли с использованием пары праймеров, специфичных для главной субъединицы HK97 хвостового белка фага Felix01 (FelixHK97f: 5'-gct ggg tta aca gta act gtt gct-3', FelixHK97r: 5'-gca aag act tac cca gac ttc a-3'). ПЦР-смеси содержали 200 мкМ dNTP, 0.4 мкМ каждого из праймеров, 2.5 ед. PeqGold Tag-DNA-Poly-merase (PEQLAB, Германия) и буфер PeqGold S. Реакции амплификации проводили в аппарате Eppendorf Mastercycler® gradient (Eppendorf, Германия) с использованием 2-минутной первичной денатурации при 94°C, 15 циклов по 15 с денатурации при 94°C и 15 с гибридизации при 65°C с приращением температуры -1°C на цикл, 30 с -элонгация при 72°C, 20 циклов по 15 с денатурации при 94°C и 15 с гибридизации при 50°C, 30 с элонгации при 72°C и окончательной элонгации 2 мин при 72°C.
Образцы были секвенированы на аппарате ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Полученный результат секве-нирования сравнивали с базой данных секвенирова-ния в National Center for Biotechnology Information (NCBI) с использованием программы nBLAST.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общее описание амбивалентных фагов
На рис. 1 показаны примеры амбивалентных фагов разных видов. Большинство фагов выделе-
Таблица 1. Антигенная структура некоторых представителей Salmonella, использованных в наших опытах
Серотип Серо-группа O-Антиген Н-Антиген
Ph. I Ph. II
S. Typhimurium B 4, 5, 12 i 1, 2
S. Indiana B 1, 4, 12 z 1, 7
S. Bovismorbificans C2 6, 8 r 1, 5
S. Hadar C2 6, 8 z10 e,n,x
S. Newport C2 6, 8 e,h 1, 2
S. Kentucky C3 8, 20 i z6
S. Lexington El 3, 10 z10 1, 5
S. enterica subsp. indica 41 b 1, 7
S. bongori 60 z41 -
Таблица 2. Адсорбция фага и2, выращенного на разных бактериях
Фаги выращены на Штамм для адсорбции Газон для посева Процент адсорбции
U2. E. coli K12 E. coli K12 E. coli K12 86
U2. E. coli
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.