ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 1, с. 29-33
UDC 579
АМИЛАЗА ИЗ ГРИБА ЕЖОВИКА ГРЕБЕНЧАТОГО Hericium erinaceum
© 2013 г. Ф. Ду*, H. X. Ван*, Т. Б. Наг**
* Государственная лаборатория агробиотехнологии кафедры микробиологии, Китайский сельскохозяйственный университет, Пекин 100193, Китай e-mail: hxwang@cau.edu.cn
**Медицинский факультет, Китайский университет Гонконга, Шатин, Новые Территории, Гонконг, Китай
e-mail: b021770@mailserv.cuhk.edu.hk Поступила в редакцию 29.03.2012 г.
Из плодовых тел гриба ежовика гребенчатого Hericium erinaceum выделена и очищена амилаза, сходная по молекулярной массе и N-концевой последовательности аминокислот с ферментом из Bacteroides thetaitaomicron. Схема очистки включала экстракцию фермента из плодовых тел дистиллированной водой, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, SP-сефарозе и FPLC на Superdex 75. Амилаза H. erinaceum сорбировалась на ДЭАЭ-целлюлозе в 10 мМ трис-HCl буфере, рН 7.4, элюировалась 0.2 М NaCl в том же буфере, на SP-сефарозе в 10 мМ трис-HCl буфере, рН 4.5, элюировалась 0.3 М NaCl в том же буфере. Собранные активные фракции подвергали очистке на FPLC на колонке с Superdex 75. На основании ДДС-ПААГ-электрофореза собранные фракции содержали гомогенный белок с молекулярной массой 55 кДа. Амилаза из H. erinaceum имела оптимум рН 4.6, температурный оптимум 40°C. Активность фермента увеличивалась в присутствии ионов Mn2+ и Fe3+, ингибировалась ионами Hg2+.
Б01: 10.7868/80555109913010042
Нвпешт вгтаевыт хорошо известен, как съедобный и лекарственный гриб в восточных странах. В последнее время проведены исследования его антимикробных и противораковых свойств. Показано, что полисахариды гриба обладают противоопухолевой активностью и в комбинации с доксорубицином являются эффективными при лечении лекарственно-устойчивой гепатоцеллю-лярной карциномы человека [1]. В 2010 г. в работе [2] было показано, что полисахариды из Н. вгтаевыт способны увеличивать активность антиок-сидантных ферментов, матричной металлопроте-иназы-1, тканевого ингибитора металлопротеи-назы-1 и уровня коллагенового белка в коже пожилых крыс. Водный экстракт Н. вгтаевыт способствовал индуции экспрессии генов в макрофагах путем активации фактора транскрипции МБ-кБ [3]. Он также способствовал проявлению естественной цитолитической активности клеток-убийц через индукцию интерлейкина-12 в спленоцитах, а также в других иммуномедиаторов или клеточных компонентов [4]. В 1994 г. Кавага-ши с соавт. [5] выделили из Н. вгтаевыт лектин ИБЬ (54 кДа), специфичный к сиаловой кислоте, который включал субъединицы с молекулярной массой 15 и 16 кЭа. В 2010 г. Ли с соавт. выделили из Н. вгтаевыт лектин (51 кДа), который был стабильный в диапазоне рН 1.9—12 и при температуре до 70°С [6]. Лектин обладал митогенной
активностью по отношению к спленоцитам, ан-типролиферативным действием по отношению к раку молочной железы и клеткам гепатомы, ин-гибирующей активностью по отношению к обратной транскрипции ВИЧ-1 [6]. Из этого же источника были выделены лакказы с новой N-кон-цевой последовательностью и молекулярной массой 63 кДа [7], дитерпеноиды эринацины H, I и Q еринакол [8].
В настоящее время в литературе нет данных о выделении амилазы (EC 3.2.1.1) из H. erinaceum. В 2008 г. Куфориджи и Фасиди [9] обнаружили ами-лазную активность в спорофорах и в склероциях Pleurotus tuber-regium, но попытки выделить фермент не было сделано.
Цель работы — выделение амилазы из гриба ежовика гребенчатого H. erinaceum, изучение ее свойств, сравнение N-концевой последовательности аминокислот с другими микробными а-амилазами.
МЕТОДИКА
Микроорганизмы и реактивы. Свежие гриба ежовика гребенчатого H. erinaceum (600 г) были приобретены в торговой сети г. Пекина (Китай). Для очистки фермента использовали ДЭАЭ-цел-люлозу фирмы "Sigma" (США), Superdex 75 HR 10/30 и систему АКТА Purifier фирмы "GE Health-
ДУ и др.
30
OD280 NaCl, М
мл
Рис. 1. Ионообменная хроматография на SP-сефаро-зе фракции D3, полученной после элюции с ДЭАЭ-целлюлозы 10 мМ трис-HCl буфером (рН 7.4), содержащим 0.2 М NaCl. Пунктирная линия — линейный градиент концентрации NaCl (0—1.0 М).
care" (США). Все остальные химические вещества, используемые в работе, были аналитической чистоты.
Выделение амилазы из H. erinaceum. Свежий гриб H. erinaceum (600 г) гомогенизировали в дистиллированной воде (2 мл/г) в блендере Варинга (США) при максимальной скорости в течение 2 мин. Гомогенат центрифугировали при 12000 g 20 мин, к супернатанту добавляли трис-HCl буфер, рН 7.4, до концентрации 10 мМ. Полученный раствор наносили на колонку (2.5 х 20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили тем же буфером для удаления не связавшихся с ионо-обменником фракций (D1), адсорбированные белки элюировали последовательно 0.1, 0.2 и 1.0 М NaCl в 10 мМ трис-HCl буфере, рН 7.4. В результате получены фракции D2, D3 и D4. Фракцию D3 диализовали против 10 мМ N^-ацетатного буфера, рН 4.5, в течение ночи перед проведением ионообменной хроматографии на SP-сефарозе (колонка 1.5 х 20 см) в том же буфере (рис. 1). После выхода неадсорбированного белка (фракция SP1) проводили элюцию линейным градиентом концентрации (0—1 М) NaCl в 10 мМ N^-ацетат-ном буфере, рН 4.5.
Фракция SP2 была элюирована 0.3 М NaCl, собрана и лиофилизирована, затем подвергнута FPLC на колонке Superdex 75 HR10/30 (рис. 2) в 0.2 М NH4HCO3 буфере, рН 8.5. Скорость потока составляла 0.4 мл/мин, объем фракций 0.8 мл. Первый пик (фракция SU1) представлял очищенную амилазу.
Определение молекулярной массы амилазы.
Электрофорез очищенного белка в ПААГ c Na-ДДС проводили по методу Лемли [10]. Гели окрашивали смесью: 0.1%-ный Кумасси голубой в растворе 30%-ного (об.) метанола и 10%-ной (об.) уксусной кислоты. Отмывку проводили в раство-
OD280
мл
Рис. 2. FPLC фракции SP2 на колонке Superdex 75.
ре, содержащем 30% (об.) метанола и 10% (об.) уксусной кислоты. Определение молекулярной массы осуществляется методом гель-фильтрации (FPLC) на колонке Superdex 75 HR10/30. В работе использовались стандарты белков с известной молекулярной массой: бычий сывороточный альбумин (67 кД), яичный альбумин (43 кД), рибону-клеаза (13 кДа), апротинин (6.5 кДа) и витамин В12 (1.355 кДа).
Анализ N-концевой аминокислотной последовательности очищенного фермента. Анализ N-кон-цевой последовательности выделенной амилазы проводили с помощью Edman degradation с использованием секвенатора Hewlett Packard 1000A (США), оснащенного системой жидкостной хроматографии высокого разрешения [11].
Количественное определение активности амилазы. Активность амилазы оценивалась по количеству восстанавливающих сахаров с 3.5-динитро-салициловой кислотой (ДНС) [12]. Разбавленный фермент (100 мкл) инкубировали в 100 мкл ацетатного буфера, рН 4.6, при 40°C в течение 5 мин, после чего добавляли 1.0%-ный растворимый крахмал (200 мкл) предварительно нагретый до температуры 40°C. Реакцию проводили в течение 10 мин и останавливали добавлением 400 мкл 0.4 М NaOH. Затем вносили 100 мкл ДНС, смесь нагревали до 100°C 5 мин, после чего определяли оптическую плотность при длине волны 520 нм. За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, которое образует 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 мин. Все реакции проведены по крайней мере трижды, рассчитаны стандартные ошибки.
Определение оптимальных рН и температуры для действия амилазы из H. erinaceum. Для определения оптимального рН, была подготовлена серия буферов с рН от 3.6 до 5.6 на основе 200 мМ солей уксусной кислоты. Фермент (100 мкл) ин-
АМИЛАЗА ИЗ ГРИБА ЕЖОВИКА ГРЕБЕНЧАТОГО Hericium erinaceum
31
кубировали при 40°С 5 мин в 100 мкл буфера, как описано выше.
Для определения оптимальной температуры, реакционную смесь инкубировали при температуре от 4 до 100°С в течение 10 мин, после чего проводили измерение активности амилазы в растворе 200 мМ уксусной кислоты, рН 4.6, по выше описанной методике.
Действие ионов металлов. Раствор фермента (10 мкл) предварительно инкубировали при 40°С в течение 2 ч с 10 мкл раствора ионов металлов в концентрациях от 1.25 до 10 мМ после чего измеряли активность амилазы.
кДа 94 67 43
30
20
14.4
Рис. 3. ДДС-ПААГ-электрофорез выделенной амилазы из H. erinaceum (фракция 8Ш). 1 — отчищенная амилаза H. erinaceum; 2 — белки-стандарты с разными молекулярными массами.
РРЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение амилазы из H. erinaceum. Активность амилазы H. erinaceum была обнаружена во фракции D3, которая десорбируется с колонки c ДЭАЭ-целлюлозой 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7.4, содержащим 0.2 М NaCl (данные не представлены). На следующем этапе очистки на SP-сефарозе фракция SP2 с активностью амилазы была отделена от фракции SP3 с гемагглютиниру-ющей активностью (рис. 1). Фракции SP2 на хро-матограмме соответствовал острый пик, который был значительно больше двух других пиков SP3 и SP4, и все же гораздо меньше, чем основной пик SP1. Фракция была разделена FPLC на Superdex 75, получены 2 пика SU1 и SU2 (рис. 2). Амилаз-ная активность была обнаружена только во фракции SU1. Таким образом, из 600 г плодовых тел было получено 147 мг фракции D3, 23 мг фракции SP2 и 10 мг фракции SU1.
Определение молекулярной массы амилазы H. erinaceum. Результаты электрофоретического исследования полученной фракции SU1 в ПААГ с ДДС представлены на рис. 3. Выделенная из H. erinaceum амилаза проявлялась в виде одной полоски белка, соответствующей молекулярной массе 55 кДа. Молекулярную массу выделенного фермента рассчитывали в соответствии со значениями Rf, используемых метчиков с 94 до 14 кДа. Очищенный белок показал одинаковую молекулярную массу, как при гель-фильтрации на Superdex 75, так и при электрофорезе в ПААГ с Na-ДДС, что указывало на то, что это мономерный белок. Его молекулярная масса близка к молекулярной массе лектина (51 кДа), выделенного и очищенного до гомогенного состояния из того же продуцента [6]. По сравнению с другими амилазами (табл. 1), молекулярная масса фермента из H. erinaceum была близка выделенным из Chrysosporium a
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.