ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 6, с. 828-830
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.322
АМИЛОИДОГЕННЫЙ ПЕПТИД, ГОМОЛОГИЧНЫЙ УЧАСТКУ Р-ДОМЕНА а-ЛАКТАЛЬБУМИНОВ
© 2007 г. В. В. Егоров, Ю. П. Гармай, К. В. Соловьев, Н. А. Грудинина, Т. Д. Алейникова, А. К. Сироткин, О. И. Киселев, М. М. Шавловский
Представлено академиком Л.Л. Киселевым 28.08.2006 г. Поступило 13.09.2006 г.
Амилоидозы - это группа заболеваний, в основе возникновения которых лежит формирование в тканях нерастворимых фибриллярных структур, состоящих из белковых молекул. Фибриллообра-зующий белок специфичен для каждой формы заболевания. К сожалению, на данный момент не существует эффективных способов лечения амилои-дозов. В настоящее время известно более 60 белков и пептидов, способных образовывать амилоидные фибриллы. Хотя все они обладают низкой степенью гомологии по первичной структуре и вне амилоидных фибрилл отличаются друг от друга по вторичной структуре, образованные ими фибриллы имеют сходные физико-химические свойства и практически не различимы по морфологии [7]. Поэтому можно предположить, что существуют общие для всех фибриллогенных белков мотивы первичной структуры, участвующие в этом процессе. С другой стороны, в качестве затравки фибрил-логенеза способны выступать только фибриллы, сформированные тем же самым белком. Таким образом, гипотетически сходные структуры должны чем-то отличаться у различных фибриллогенных белков [3]. Целенаправленное воздействие на такие участки могло бы привести к ингибированию фибриллогенеза белков и препятствовало бы образованию олигомерных интермедиатов, токсичных для клеток. Показано, что такие олигомеры образуются и при фибриллогенезе а-лактальбу-мина человека (АЛЧ) [9]. Целью нашего исследования было выявление общих для некоторых фибриллогенных пептидов особенностей первичной структуры, поиск таких особенностей в аминокислотной последовательности а-лактальбу-мина и выяснение их роли в фибриллогенезе это-
го белка. В результате исследования впервые обнаружено, что некоторые амилоидогенные пептиды содержат зеркально-симметричные мотивы. Такой мотив найден в последовательности а-лактальбуминов. Показано, что пептид, гомологичный участку ß-домена а-лактальбуминов и содержащий такой зеркально-симметричный мотив, способен к фибриллогенезу. Разработан метод компьютерного моделирования фибриллогенеза коротких пептидов.
Анализ последовательностей амилоидогенных пептидов. При компьютерном анализе первичной структуры четырех способных к фибриллогенезу пептидов (амилоид ß, островковый амилоидный полипептид (Islet Amyloid Polypeptide) [12], фрагмент лизоцима фага Т4 [6], пептид 105-115 транс-тиретина [2]) мы обнаружили, что аминокислотные последовательности этих пептидов содержат так называемые зеркально-симметричные мотивы (ЗСМ) (рис. 1а). Зеркально-симметричный мотив представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности, содержащий центр симметрии, на равном расстоянии от которого по направлению к N- и С-концу находятся идентичные или близкие по структуре аминокислоты.
Создание пептида, гомологичного ß-домену АЛЧ. При поиске ЗСМ в последовательности АЛЧ мы обнаружили, что максимальной симметрией обладает участок ß-домена с 35 по 51 аминокислотный остаток. Гомологичные этому фрагменту участки лактальбуминов других млекопитающих также содержали ЗСМ (рис. 1б). На основании анализа симметрии и гомологии мы предложили наиболее симметричную и максимально гомологичную лактальбуминам млекопитающих последовательность пептида. Таким образом, получили следующую последовательность пептида (ID1): NH2-GYDTQTVVNNNGHTDYG-COOH.
Моделирование фибриллогенеза пептида ID1 in silico. Было проведено моделирование возможных структур такого пептида in silico с помощью оригинальной программы, написанной на языке С и использующей методы молекулярной механики, реализованные в пакете программ TINKER-WIN-
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии медицинских наук, Санкт-Петербург
Научно-исследовательский институт гриппа Российской Академии медицинских наук, Санкт-Петербург
АМИЛОИДОГЕННЫЙ ПЕПТИД, ГОМОЛОГИЧНЫЙ УЧАСТКУ
829
DOWS [11]. Далее был проведен поиск наиболее энергетически выгодного взаимного расположения (докинг) полученных структур с использованием программы Hex 4.5 [8]. При последовательном докинге полученных в результате моделирования in silico мономеров и олигомеров пептида учитывали только структуры, образование которых приводило к понижению энергии системы. Некоторые такие структуры были способны к образованию фибриллоподобных агрегатов (рис. 2а). Пептид ID1 был синтезирован в ООО "НПФ Верта" (чистота препарата более 80%). С помощью электронной микроскопии (рис. 26) и анализа флуоресценции тиофлавина Т [5] показано, что в условиях, способствующих фибриллоге-незу АЛЧ, он образует амилоидные фибриллы.
Обсуждение результатов. ЗСМ, обнаруженные в фибриллогенных пептидах, описаны ранее как характерные для функциональных сайтов белков, участвующих в белок-белковых взаимодействиях и в связывании металлов. Происходившие на начальных этапах эволюции мультипликации фрагментов генома могли привести к распространению первоначально возникших участков ДНК, кодировавших ЗСМ. В важных для биологической активности белка участках первичная структура претерпевала наименьшие изменения в процессе эволюции. Поэтому именно в таких участках внутренняя симметрия сохранилась в наибольшей степени [1]. Присутствие ЗСМ в аминокислотной последовательности белка не обязательно приводит к способности такого белка к фибриллогенезу, хотя недавно была высказана гипотеза, согласно которой при определенных условиях практически все белки способны образовывать амилоидные фибриллы [4]. С другой стороны, не все амилоидогенные пептиды содержат ЗСМ. По-видимому, для фибрилло-генеза важна не только симметрия, но и свойства аминокислотных остатков, находящихся в симметричных позициях. Интересно, что в созданной нами компьютерной модели пространственной структуры фибриллы, образованной из симметричного пептида, существенную роль играют ароматические и отрицательно заряженные остатки в симметричных позициях, в то время как центральный (несимметричный) элемент не участвует во взаимодействиях, обусловливающих образование димеров.
Для выяснения роли ЗСМ в фибриллогенезе необходимо понять механизмы участия таких мотивов в межмолекулярных взаимодействиях. Параллельное изучение свойств пептида in vitro и моделирование его поведения in silico позволяет выбирать наиболее адекватные методы моделирования. Такой подход может привести к значительному сокращению материальных и временных затрат на эксперименты по изучению механизмов фибриллогенеза.
(a)
AP(N-C) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT AP(C-N) TAIWGGVMLGIIAGKNSGVDEAFFVLKQHHVEYGSDHRFEAD
TTR(N-C) TTR(C-N)
T4LYZ(N-C) T4LYZ(C-N)
YTIAALLSPYSY YSYPSLLAAITY
EGLRLKIYKDTEGYYIIGIGH HGIGIIYYGETDKYIKLRLGE
IAPPN-C) NTATCATQRIANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSN
IAPPC-N) NSGVNT SSL IAGFNNS SHVLFNALRQTACTATN
* - •• .** * **- .*
(6)
Homo sapiens (C-N) Homo sapiens (N-C)
Bos taurus (N-C) Bos taurus (C-N)
Equus caballus (N-C) Equus caballus (C-N)
Cavia porcellus (N-C) Cavia porcellus (C-N)
GYDTQAIVENNESTEYG GYETSENNEVIAQTDYG
GYDTQAIVQNNDSTEYG GYETSDNNQVIAQTDYG
GYDTQTIVKNNGKTEYG
GYETKGNNKVITQTDYG ** • *• * •★•**
GYDTQAIVKNSDHKEYG GYEKHDSNKVIAQTDYG
Cervus elaphus xanthopygus (N-C) GYDTQAIVQNDDSTEYG
Cervus elaphus xanthopygus (C-N) GYETSDDNQVIAQTDYG
**•* * *.**
Delphinus delphis (N-C) Delphinus delphis (C-N)
Lipotes vexillifer (N-C) Lipotes vexillifer (C-N)
Mus musculus (N-C) Mus musculus (C-N)
Sotalia fluviatilis (N-C) Sotalia fluviatilis (C-N)
Canis familiaris (N-C) Canis familiaris (C-N)
ID1 (N-C) ID1 (C-N)
GCDTQTIVNNNDSTEYG GYETSDNNNVITQTDCG
GCDTQTIVNNNGSTEYG
GYETSGNNNVITQTDCG * : * * * : *
GYDTQAVVNDNGSTEYG
GYETSGNDNVVAQTDYG **•* * *.**
GCDTQTIVNNSDSTEYG GYETSDSNNVITQTDCG
GYDTQTIVNNNGGTDYG GYDTGGNNNVITQTDYG
GYDTQTVVNNNGHTDYG GYDTHGNNNVVTQTDYG
Рис. 1. а - результаты поиска с помощью программы CLUSTAL X (1.83) [10] зеркально-симметричных мотивов в последовательностях пептидов, способных к фибриллогенезу. (N-C) или (C-N) - прямое или обратное соответственно направление цепи, AP - амилоид ß, TTR - пептид 105-115 транстиретина человека, T4LYZ - центральный фрагмент пептида из лизоцима фага Т4, IAPP - центральный фрагмент островкового амилоидного полипептида (Islet Amyloid Polypeptide). б - ЗСМ в последовательностях ß-доменов а-лак-тальбуминов млекопитающих и пептид ID1.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 414 № 6 2007
830
ЕГОРОВ и др.
Рис. 2. а - олигомер из восьми мономеров, полученный в результате докинга пептида GYDTQTVVNNNGHTDYG, пространственная структура которого смоделирована in silico. Графическое представление структуры осуществлено с помощью программы Vega ZZ, представление trace. б - электронная микрофотография фибрилл, образованных пептидом GYDTQTVVNNNGHTDYG. Исследование образца производили на электронном микроскопе JEOL JEM 100S при ускоряющем напряжении 80 кВ. 50000Х, негативное контрастирование 1.5%-ным раствором натриевой соли фосфор-но-вольфрамовой кислоты (рН 7.4). Масштабная линейка - 10 нм.
Амилоидогенный пептид ID1 является хорошей моделью для изучения механизмов фибрил-логенеза. Поиск ингибиторов фибриллогенеза для пептида и последующая проверка влияния их аналогов на фибриллогенез и токсические свойства префибриллярных форм белка может привести к разработке новых подходов к созданию средств для борьбы с амилоидозами.
Авторы глубоко признательны рецензенту за исключительно тщательный анализ рукописи, замечания, исправления и предложения, которым мы последовали.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Шпаков А.О. // Цитология. 1998. Т. 40. № 2/3.
С. 210-221.
2. Jaroniec C P, MacPhee C.E., Astrof N.S. // Proc. Nat.
Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 26. P. 16748-16753.
3. Krebs M.R.H., Morozova-Roche LA, Daniel K. et al. // Prot. Sci. 2004. № 13. P. 1933-1938.
4. Lansbury P.T, Jr. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 3342-3344.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.