научная статья по теме АММИАК И ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА АММИАКА В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ МОЗГА ПРИ ГИПЕРАММОНИЕМИИ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «АММИАК И ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА АММИАКА В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ МОЗГА ПРИ ГИПЕРАММОНИЕМИИ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 2, с. 160-168

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.121.7-612.82

АММИАК И ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА АММИАКА В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ МОЗГА ПРИ ГИПЕРАММОНИЕМИИ © 2015 г. Е. А. Косенко1, 2, Л. А. Тихонова1, 2, Ю. Г. Каминский1, *

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино

Гипераммониемия играет центральную роль в патогенезе гепатоэнцефалопатии, однако механизмы, ведущие к такому нарушению функции мозга, пока не до конца ясны. Неизвестно также, как реагируют на избыток аммиака ферменты обмена аммиака и глутамата в разных отделах мозга. Мы исследовали влияние аммиака на каталитическую активность ключевых ферментов обмена аммиака и глутамата в митохондриях и цитоплазме неокортекса, мозжечка, гиппокампа, стриатума и печени. Выяснилось, что острая гипераммониемия, вызванная введением крысам летальной дозы ацетата аммония, приводит к повышению содержания аммиака во всех тканях, которое коррелирует с первоначальным эндогенным содержанием аммиака в этих тканях. Активность всех анализируемых ферментов — глутаминсинтетазы, глутаминазы, глутаматдегидрогеназы, аденозиндезамина-зы, АМФ-дезаминазы, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы — распределяется неравномерно в четырех отделах мозга и печени и изменяется разнонаправленно при острой аммиачной интоксикации. Результаты позволяют предполагать, что аммиак- и глутамат-метаболизиру-ющие ферменты функционально различны в разных тканях и что в печени, неокортексе, мозжечке, стриатуме и гиппокампе функционируют фундаментально разные механизмы их регуляции. Эти данные вносят новый вклад в наше понимание патогенеза гепатоэнцефалопатии и других проявлений гипераммониемии.

Ключевые слова: аммиак-метаболизирующие ферменты, гипераммониемия, неокортекс, мозжечок, гиппокамп, стриатум, печень.

Б01: 10.7868/81027813315020089

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДА — аденозиндезаминаза, АЛТ — аланина-минотрансфераза, АСТ — аспартатаминотранс-фераза, ГДГ — глутаматдегидрогеназа, ГС — глута-минсинтетаза.

ВВЕДЕНИЕ

В живой клетке аммиак является субстратом для биосинтеза и продуктом распада аминокислот, белков и других азотистых соединений. Повышенная концентрация аммиака в крови, или гипераммониемия, играет центральную роль в патогенезе гепатоэнцефалопатии, однако механизмы, ведущие к такому нарушению функции мозга, пока не до конца выяснены. Причинами гепатоэнцефалопатии являются, в частности, нарушения в энергетическом обмене в мозге [1], и эти нарушения подробно изучены в экспериментах на животных [2, 3]. В патогенез гепатоэнцефалопатии могут быть вовлечены также изменения в

* Адресат для корреспонденции: 142290, Пущино, ул. Институтская, д. 3; тел.: (496) 773-52-46; e-mail: kaminsky@iteb.ru.

промежуточном обмене [4]. Образование и удаление аммиака осуществляются в ряде ферментных систем и обычно связаны с обменом глутамата. Концентрация аммиака внутри клетки определяется балансом между аммиак-образующими и аммиак-потребляющими ферментными системами в цитоплазме и митохондриях. Важную роль играют цитоплазматические ферменты глутаминсинтетаза (ГС), аденозиндезаминаза (АДА) и АМР-дезамина-за, митохондриальные глутаминаза и глутаматде-гидрогеназа (ГДГ). И в цитозоле, и в митохондриях распределены аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ), непрямо участвующие в обмене аммиака через образование глутамата и аланина в катализируемых ими реакциях переаминирования. Изменение активности любого из этих ферментов может приводить к нарушению обмена аммиака в клетке и к вызванной им токсичности.

Неизвестно, однако, какой отдел мозга ответствен за патогенез гепатоэнцефалопатии и одинаково ли реагируют на патологию ферменты обмена аммиака и глутамата в разных отделах.

Мы исследовали влияние введения крысам аммиака в дозе, действующей на функцию митохондрий мозга [3], на каталитическую активность ключевых ферментов обмена аммиака и глутама-та ГС, глутаминазы, ГДГ, АДА, AMP-дезаминазы, АСТ и АЛТ в митохондриях и цитоплазме неокор-текса, мозжечка, гиппокампа и стриатума. В сравнительных целях эти же показатели анализировали в митохондриях и цитоплазме печени. Выяснилось, что в четырех отделах мозга и печени активность всех перечисленных ферментов отличается количественно и различно изменяется при гипераммониемии. Эти результаты позволяют предполагать, что каждый фермент обмена аммиака и глутамата в мозге вносит специфический вклад в патогенез гепатоэнцефалопатии и других проявлений гипераммониемии, и указывают на фундаментальные отличия механизмов регуляции ферментативной активности в четырех отделах мозга и печени.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные процедуры выполнены в соответствии с Европейскими Правилами по использованию лабораторных животных 1986 г. (пересмотренными в Директиве 2010/63/EU Совета Европы и изложенными в Приказе Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 № 267 "Правила лабораторной практики в РФ").

В экспериментах использовали крыс Вистар массой 220—250 г, содержащихся в виварии по четыре особи на клетку размерами 40 х 30 х 20 см с двухэтажным интерьером при комнатной температуре, естественном режиме освещения, свободном доступе к корму и воде.

Животным одной группы внутрибрюшинно вводили ацетат аммония в летальной дозе 12 ммоль на 1 кг массы тела. Контрольным крысам вводили физраствор в том же объеме. Поскольку крысы экспериментальной группы погибали через 13 ± 2 мин после введения этой дозы ацетата аммония [5], мы выполняли декапитацию через 11 мин. Животных контрольной группы декапитировали через 11 мин после введения физраствора.

В основном использовали реактивы фирмы "Sigma Chemical Co." (St. Louis, USA): Tris, HEPES, NAD+, NADH, ATP, AMP, GSH, набор химреактивов MAK055-1KT, сахароза, маннит, глутамат, глутамин, аденозин, ГДГ, ЭГТА, ЭДТА, фиколл, фенилметилсульфонилфторид, дитио-треитол, лейпептин, пепстатин, апротинин А, ро-тенон.

Все препаративные процедуры проводили при 2—4°C.

Печень извлекали из брюшной полости в течение не более 7 с после декапитации и переднюю долю помещали в раствор для промывания, содержащий 5 мМ HEPES, pH 7.4, 210 мМ маннит и 70 мМ сахарозу. Параллельно с этим вскрывали черепную коробку и извлекали мозг (20 с от момента декапитации), отделяли неокортекс, гип-покамп, мозжечок и полосатое тело (не более 3 мин от момента декапитации) согласно анатомическому атласу и помещали в охлажденный буферный раствор, содержащий 10 мМ Tris, рН 7.4, 0.25М сахарозу и 0.5 мМ ЭГТА.

Печень гомогенизировали в 9 объемах среды, содержащей 210 мМ маннит, 70 мМ сахарозу, 5 мМ HEPES-буфер, pH 7.4, 1 мМ ЭДТА и 0.5 мг/мл БСА.

Массы неокортекса, мозжечка, гиппокампа и стриатума составляли 700-1000, 200-340, 60-120 и 40-100 мг соответственно. Поэтому для получения одного препарата митохондрий и цитоплазмы из гиппокампа и стриатума мы объединяли ткани от 2-3 животных. Образцы крови, неокор-текса, мозжечка и печени получали от одного животного. Результаты приведены для 6 препаратов, полученных от 6 крыс (в случаях плазмы, печени, неокортекса и мозжечка) или от 14 или 16 крыс (в случаях гиппокампа и стриатума).

Ткани каждого отдела мозга гомогенизировали в 9 объемах 10 мМ Tris-буфера, pH 7.4, содержащего 0.25 М сахарозу и 0.5 мМ ЭДТА. Несинапти-ческие митохондрии выделяли из каждого отдела мозга методом, описанным ранее [6]. Ткань мозга измельчали ножницами при частом промывании охлажденной средой для удаления остатков крови, затем гомогенизировали в 5 мл среды выделения с помощью гомогенизатора Даунса и ручного вращения пестика. Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, супернатант центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, а полученный супернатант - при 12000 g в течение 8 мин для получения митохондрий в осадке. Этот осадок суспендировали в 0.5 мл среды с 3%-ным фи-коллом, наслаивали на 3 мл среды с 6%-ным фи-коллом (3 или 6 массовых процентов фиколла, 0.24 М маннит, 60 мМ сахароза, 0.05 мМ ЭДТА и 10 мМ Tris-HCl, pH 7.4) и центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин. Верхний белый рыхлый слой удаляли. Оставшийся коричневый осадок суспендировали в среде выделения, не содержащей ЭДТА, и снова центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Осадок, содержащий очищенные несинаптические митохондрии [6], суспендировали в той же среде без ЭДТА. Количественную оценку чистоты митохондрий выполняли, как ранее [6], по активности ферментов-маркеров субклеточных фракций.

Плазма Мозжечок Стриатум

Неокортекс Гиппокамп

Рис. 1. Содержание эндогенного аммиака в плазме и отделах мозга контрольных крыс. **р < 0.01, ***р < 0.001 при сравнении с плазмой; + р < 0.05, +++р < 0.001 при сравнении с мозжечком (ANOVA с поправкой Бон-феррони).

Постмитохондриальный супернатант подвергали центрифугированию при 100 000 g и 4°С в течение 30 мин, и полученный супернатант использовали как цитоплазматическую фракцию.

Митохондриальные мембраны разрушали осмотическим шоком (в 5 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 0.1 мМ ЭГТА, 0.5 мМ фенил-метилсульфонилфторид, 1 мМ дитиотреитол, 10 мкМ лейпептин, 1.5 мкМ пепстатин и 0.15 мкМ апротинин А) при 4°С в течение 15 мин с последующими тремя циклами замораживания-размораживания. Активность митохондриальных ферментов определяли в лизате. Концентрация белка в лизате митохондрий составляла 2—3.5 мг/мл.

Митохондрии и цитоплазматические фракци-ии печени и мозга выделяли методами, описанными ранее [3, 7, 8].

Активность глутаминазы (КФ 3.5.1.2) определяли спектрофотометрически по образованию глутамата [9]. 0.1 мг белка митохондрий инкубировали в среде, содержащей 150 мМ фосфат калия и 50 мМ Тт-НО, рН 8.6, 0.2 мМ ЭДТА, 10 мМ глутамин и 1 мкМ ротенон, при 37°С. После 10 мин инкубации реакцию останавливали добавлением 0.1 мл этанола. Концентрацию образованного глутамата измеряли в реакции ГДГ по восстановлению NAD+ при 340 нм.

Активность ГДГ (КФ 1.4.1.3) определяли спек-трофотометрически при 340 нм и 37° С по окислению NADH [10]. Ферментативную реакцию запускали добавлением 20 мкг белка (митохондрий печени) или 40 мкг белка (митохон

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»