УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 1, с. 34-43
УДК 57.083.1
АНАЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
© 2007 г. М. Г. Анюшева, С. В. Калюжный
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Рассмотрены физиология, структура клетки, биохимические особенности и филогения анаммокс-бактерий, способных в анаэробных условиях проводить автотрофное окисление аммония, используя нитрит в качестве акцептора электронов, с образованием молекулярного азота. Показано, что внутриклеточными интермедиатами этого процесса являются гидразин и гидроксиламин. Присутствие такого высоко реакционноспособного интермедиата как гидразин привело в процессе эволюции этих бактерий к образованию у них уникальной органеллы - анаммоксомы, где, собственно, и осуществляется данный необычный процесс. В мембране анаммоксомы содержатся не встречающиеся нигде более уникальные ладдеральные липиды и гопаноиды. Установлено, что относящиеся к порядку Planctomycetales анаммокс-бактерии, обладая схожей физиологией и морфологией, сильно различаются между собой и другими бактериями этого порядка на генетическом уровне. Проанализированы технологические перспективы применения анаммокс-процесса и его роль в глобальном цикле азота. Обобщены последние достижения в этой области.
ВВЕДЕНИЕ
Долгое время считалось, что микробное окисление аммония может происходить только в аэробных условиях [13]. И только в 70-е годы XX века термодинамическими расчетами было показано, что аммоний может быть также окислен до молекулярного азота и в анаэробных условиях при использовании нитрита в качестве акцептора электронов [3]. Оказалось, что анаэробное окисление аммония энергетически даже более выгодно по сравнению с аэробным процессом:
NHI + NO2
N2 + 2H2O,
AG = -357 кДж/моль NH+,
NHI + 3/202
NO- + H2O + 2H+
AG = -275 кДж/моль NH+,
NH+ + 2O2
NO- + H2O + 2H+
AG = -349 кДж/моль NH+.
(1)
(2)
(3)
В конце 80-х годов XX века возможность микробного анаэробного окисления аммония, получившего название анаммокс-процесс (ANAMMOX -А№егоЫс АММота OXidation), была доказана экспериментально [20, 49, 50]. В дальнейшем было установлено, что важными внутриклеточными интермедиатами интегральной микробной реакции (1) являются гидроксиламин и гидразин [24, 30].
Впервые консорциум, проводящий окисление аммония в анаэробных условиях, идентифицирован в Голландии в денитрифицирующем иле пи-
лотной установки, обрабатывающей сточные воды дрожжевого производства [20]. Основываясь на результатах филогенетического анализа, доминирующая бактерия данного консорциума была отнесена к порядку Planctomycetales и названа Candidatos Brocadia Anammoxidans [36, 40]. Вскоре после открытии данного процесса [20] с промышленных очистных сооружений Германии [28], Бельгии [21], Японии [7] Австралии [47] и США [46] и установок по обработке фильтратов полигонов твердых бытовых отходов (ТБО) в Швейцарии [5] и Англии [28] начали поступать сообщения о наблюдаемых потерях соединений азота, которые могли быть объяснены реализацией анаммокс-реакции. Проведенные молекулярно-биологиче-ские исследования соответствующих микробных сообществ действительно показали наличие бактерий, которые тоже относятся к типу Plancto-mycetes, некоторые из которых, правда, находились в достаточно дальнем родстве с ветвью Brocadia. Так была выделена вторая группа анаммокс организмов, основной представитель которой назван Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis [5].
Бактерии, осуществляющие анаэробное окисление аммония, были позже обнаружены и в природных экосистемах. Так, из неаэрируемой зоны Черного моря выделен организм, названный Candidatus Scalindua Sorokinii. Это первая анаммокс-бактерия, которая напрямую участвует в удалении связанного неорганического азота в естественной экосистеме. Дальнейшие исследования анаммокс-процесса привели к открытию других видов анам-мокс-бактерий, относящихся к описанным ранее родам статуса кандидатов: Candidatus Brocadia Fulgida [16], Candidatus Scalindua Wagneri, Candida-
Таблица 1. Известные культуры анаммокс-микроорганизмов и их среды обитания
Анаммокс-микроорганизм Система Ссылка
Candidatus Brocadia Anammoxidans Ил пилотного реактора очистки сточных вод (Голландия) [14]
Candidatus Brocadia Fulgida Ил очистных сооружений [16]
Candidatus Scalindua Sorokinii Аноксич. зона Черного моря; [17]
Осадки мелководного эстуария (Дания); [22]
Шельфовые воды Намибии; [18]
Ил очистных сооружений (Великобритания) [29]
Candidatus Scalindua Brodae Шельфовые воды Намибии; [18]
Ил очистных сооружений (Великобритания) [29]
Candidatus Scalindua Wagneri Ил очистных сооружений (Великобритания) [29]
Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis Ил очистных сооружений (Великобритания) [5, 21]
tus Scalindua Brodae [29]. Среднее сходство нуклео-тидных последовательностей 16S рРНК между тремя родами анаммокс-бактерий (Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia, Ca. Scalindua) составляет примерно 90%. Таким образом, филогенетическое расстояние между микроорганизмами группы анаммокс достаточно велико. Однако, несмотря на это, они обладают схожей морфологией и физиологией.
ФИЗИОЛОГИЯ АНАММОКС-БАКТЕРИЙ
Все известные к настоящему моменту анам-мокс-организмы выделены из сильно отличающихся по своим характеристикам водных сред: различных промышленных стоков и осадков, морских осадков, толщи воды Мирового океана, пресноводных осадков (табл. 1). При соотношении в среде углерода к азоту >1 анаммокс-бакте-рии не способны конкурировать с гетеротрофными денитрифицирующими бактериями [8]. Это объясняет то, что и в природе, и в искусственных системах анаммокс-бактерии обнаружены только в системах с малым содержанием органического вещества.
Необходимо отметить две отличительных черты анаммокс-бактерий, выделенных из антропогенных систем: низкую скорость роста и мутуализм. Время удвоения анаммокс-организмов при оптимальных условиях лаборатории составляет 11 суток, а в реальных системах, в среднем, 23 недели. Такие низкие скорости роста приводят к тому, что время, за которое можно получить накопительную культуру, обычно занимает от 100 до 200 суток, что и объясняет многочисленные неудачи с выделением соответствующих чистых культур. Выход биомассы анаммокс-бактерий составляет 0.07 моля связанного углерода на моль
окисленного NH+. Низкая скорость роста анаммокс-организмов, вероятно, объясняется низкой скоростью утилизации субстратов. Тем не менее, на основании многочисленных исследований было показано, что анаммокс-активность в столбе
морской воды в Черном море составляет ~2 фмоль КН+ /клетка/сутки, что хорошо соотносится с анаммокс-активностью, полученной для лабораторных культур, составляющей 2-20 фмоль
1ЧН+ /клетка/сутки, при 30°С [29, 45].
Анаэробное окисление аммония обычно не лимитируется концентрацией аммония, которая, как правило, относительно высока как в естественных, так и в искусственных системах, но сильно зависит от доступности акцептора электронов - нитрита. В реакторах с ограниченной подачей кислорода кластеры анаммокс бактерий находятся возле кластеров аэробных аммоний-окисляющих бактерий, которые превращают аммоний в нитрит и одновременно предохраняют анаммокс-бактерии от воздействия кислорода. Иногда они образовывают совместные агрегаты, в которых на внешней части присутствуют аэробные бактерии, а во внутренней - анаммокс-орга-низмы [7, 12, 21]. Источником нитрита также может являться процесс денитрификации. В этом случае происходит восстановление нитрата до нитрита, который затем может быть использован анаммокс-бактериями [15, 48, 49].
Для бактерий Candidatus Brocadia Аштшохь dans и Candidatus Киепеша Stuttgartiensis показано, что проявление анаммокс-активности зависит от численности клеточной популяции. Активность исследованных культур может наблюдаться только при их относительно высокой численности, пороговые значения которой могут достаточно сильно различаться для этих культур - от 108 до 1011 кл/мл [39]. В лабораторных условиях и при обработке сточных вод анаммокс-бактерии находятся в плотных кластерах клеток, при этом значение их локальной численности всегда высокое, однако во многих природных экосистемах большинство анаммокс-бактерий обитает как единичные клетки. Причины такого различия в поведе-
Таблица 2. Сравнение свойств Candidatus Brocadia an-ammoxidans и вида, близкого к Candidatus Kuenenia Stut-tgartiensis (98.5-98.9% сходства)
Параметр Brocadia Kuenenia
Н+), мкМ <5 *
О-), мкМ <5 *
Ингибирующая концентрация >2 >20
Р О3-, мМ
Ингибирующая концентрация >20 >13
N О2, мМ
Ингибирующая концентрация >2 *
02, мкМ
рН оптимум 8.0 8.0
Температурный оптимум, °С 40 37
Анаммокс-активность, 55 26.5
нмоль ^/мин/мг белка
Ссылка [13] [5]
* Нет данных.
нии анаммокс-бактерий в природных и искусственных системах еще не ясны [45].
Попытки выделения чистых культур анаммокс-бактерий с помощью классических методов долгое время были безуспешными, поэтому большинство данных по их физиологии и биохимии получено для накопительных культур двух видов анаммокс-бактерий Candidatus Brocadia апаттох-idans и Candidatus Киепеша Stuttgartiensis. Необходимо отметить, что недавно с помощью метода градиентного центрифугирования была получена практически чистая (1 примесная клетка на 1000 клеток) культура Candidatus Brocadia anam-moxidans [43].
Клетки анаммокс-бактерий в диаметре составляют около 1 мкм, для некоторых видов характерна кокковидная форма, для других - нерегулярная изрезанная [5, 29, 52]. По своему типу питания анаммокс-бактерии являются хемолитоавтотро-фами, а по типу дыхания - строгими анаэробами. Хемолитоавтотрофная природа анаммокс-бакте-рий была установлена специальными экспериментами по включению 14С02 в клетки и подтверждена массовым балансом.
Недавние исследования [8] показали, что анаммокс-бактерии не являются облигатными хемоли-тоавтотрофами: органические кислоты (например, пропионовая и уксусная) также усваиваются анаммокс-бактериями. Пропионат в основном окисляется до углекислого газа с нитратом и/или нитритом в качестве акцептора э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.