ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 2, с. 232-235
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.112.083
АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НОВЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ КУНИТЦ-ТИПА АКТИНИИ Heteractis crispa
© 2015 г. В. М. Табакмахер, О. В. Синцова, О. Н. Кривошапко, Е. А. Зелепуга, М. М. Монастырная, Э. П. Козловская
Представлено академиком РАН В.А. Стоником 06.06.2014 г. Поступило 29.09.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215080277
К настоящему времени накоплен большой массив экспериментальных данных, демонстрирующих роль клеточных рецепторов и ионных каналов возбудимых и невозбудимых мембран периферической и центральной нервной системы в процессах восприятия и передачи болевых стимулов [1]. Нарушение функционирования этих мембранных компонентов может являться причиной развития различных каналопатий и хронической боли. В связи с этим поиск и изучение молекул, специфично и селективно взаимодействующих с ионотропными рецепторами и ионными каналами, является одной из важнейших задач комплекса наук, исследующих молекулярную организацию и механизмы функционирования живых систем.
Стабильность пептидных компонентов ядов животных в сочетании с их биологической активностью, селективностью и специфичностью действия на молекулярные мишени позволяет использовать эти соединения в качестве уникальных биомедицинских инструментов и моделей для разработки терапевтических препаратов [2]. Именно поэтому полипептиды структурного семейства Кунитца, обнаруженные в ядах актиний различных видов, модулирующие и блокирующие ионные каналы [3], вызывают возрастающий интерес исследователей.
Ранее в результате исследования ингибиторов сериновых протеиназ актинии Heteractis crispa было обнаружено, что полипептид APHC1 обладает уникальной способностью ингибировать болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 [4] и оказывать анальгетическое действие in vivo [4, 5]. Позднее было показано, что гомологичные полипептиды APHC2 и APHC3 проявляют аналогичные свойства [6].
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской Академии наук, Владивосток E-mail: tabval@yandex.ru
Электрофизиологические исследования на экспрессированных в ооцитах лягушки каналах TRPV1 и на моделях тепловой стимуляции боли показали, что, несмотря на неполное (до 35%) ин-гибирование функции канала, анальгетические полипептиды APHC1—APHC3 блокируют передачу болевого сигнала, при этом достигаемый обезболивающий эффект в сотни раз превышает эффект морфина [4, 6]. В результате недавних исследований in vivo было обнаружено, что, в отличие от большинства низкомолекулярных антагонистов TRPV1, полипептиды APHC1 и APHC3 оказывают анальгетический эффект, сопровождаемый гипотермией [7], вероятно, вследствие совместного действия на болевой ваниллоидный рецептор и протеиназы воспаления [8].
Полученные экспериментальные данные говорят о высоком терапевтическом потенциале полипептидов APHC1—APHC3, что отражено в материалах патента [9]. Однако молекулярный механизм анальгетического действия полипептидов из H. crispa пока не выяснен.
В 2012 г в генетическом материале H. crispa с помощью техники ПЦР-амплификации и методов молекулярного клонирования мы обнаружили мульти-генное семейство, гены которого кодируют полипептиды Кунитц-типа (так называемые HCGS-полипептиды) [10]. Высокая степень идентичности и точечные замены в экспрессируемых аминокислотных последовательностях свидетельствуют о том, что полипептиды формируют природную комбинаторную библиотеку.
В результате проведенного структурного, филогенетического и биоинформационного анализа, а также компьютерного моделирования мы установили, что несколько представителей комбинаторной библиотеки высокогомологичны полипептидам APHC1—APHC3 (рис. 1а) [11]. Проведенное in silico исследование показало, что в рамках предложенной нами модели [11] полипептиды HCGS 1.10 и HCGS 1.36 способны взаимодействовать с рецептором TRPV1 и, возможно,
Рис. 1. (а) — дендрограмма полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa, сгруппированных по подобию молекулярного электростатического потенциала (фрагмент рисунка из [11]). (б) — множественное выравнивание аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа: APHC1 (UniProt B2G331), APHC2 (UniProt C0HJF4), APHC3 (UniProt C0HJF3) и HCGS-полипептиды [10] из H. crispa, SHPI-1 (UniProt P31713) и SHPI-2 (UniProt P81129) из Sti-chodactyla helianthus, БПТИ (UniProt P00974) из Bos taurus. На сером фоне показаны идентичные остатки. Сверху указаны номера аминокислотных остатков.
оказывать анальгетическое действие in vivo. На основании анализа молекулярного электростатического потенциала полипептидов комбинаторной библиотеки H. crispa было высказано предположение о том, что большинство из них не способно взаимодействовать с рецептором TRPV1 [11], в том числе полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20 (рис. 1б). Эти полипептиды принципиально отличаются от APHC1—APHC3 по распределению положительных и отрицательных зарядов на поверхности молекулы.
Для объяснения молекулярных основ анальге-тического действия APHC1—APHC3 и выявления новых соединений, которые специфично взаимодействуют с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1, необходима экспериментальная проверка полученных расчетных данных. В связи с этим целью данной работы являлось исследование in vivo анальгетического действия полипептидов семейства Кунитца из комбинаторной библиотеки актинии H. crispa HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20 и HCGS 1.36 на модели тепловой стимуляции боли.
Поскольку исследуемые полипептиды не были ранее обнаружены ни в ядах, ни в экстрактах не-матоцистов или цельных актиний H. crispa, мы разработали методы их получения в рекомби-нантной форме. Фрагменты ДНК, кодирующие полипептиды, амплифицировали на матрицах генов из ранее полученной библиотеки [10] и клонировали в плазмидный вектор pET32b(+) после нуклеотидной последовательности, кодирующей тиоредоксин и гистидиновый тег. Результирующими генетическими конструкциями трансформировали клетки штамма E. coli BL21(DE3). Затем клетки инкубировали для наращивания клеточной массы и индуцировали экспрессию добавлением изопро-пил^^-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Целевые рекомбинантные полипептиды получали в составе гибридного белка с тиоредоксином и выделяли при помощи металл-аффинной хромато-
графии на №2+-агарозе. Гибридный белок гидро-лизовали BrCN в кислых условиях и выделяли при помощи обращённо-фазовой ВЭЖХ.
Исследование анальгетического эффекта ИСС8 1.10, ИСС8 1.19, ИСС8 1.20 и ИСС8 1.36 на экспериментальной модели тепловой стимуляции боли проводили на мышах аутбредной линии CD-1 с использованием теста отдергивания хвоста. Модели тепловой стимуляции боли основаны на активации рецептора ТЯРУ1 [5, 6]. Известно, что ТЯРУ1 является одним из ключевых компонентов системы болевой рецепции организма. С функциональной точки зрения ТЯРУ1 представляет собой неселективный Са2+-канал, который активируется теплом (>43° С), кислотами (рИ < 5.3), ваниллоидами, медиаторами воспаления липидной природы, а также при повреждении тканей [12].
Внутрибрюшинное введение рекомбинантных полипептидов (до 5 мг/кг) не оказывало токсического действия. Было показано, что полипептиды ИС08 1.36 и ИСС8 1.10, как и предполагалось, вызывают анальгетический эффект на модели тепловой стимуляции боли (в концентрации 0.5 мг/кг) (рис. 2а).
Интересно, что, несмотря на высокую структурную гомологию (рис. 1б), обезболивающее действие ИСС8 1.36 значительно выше, чем действие ИСС8 1.10. С другой стороны, анальгетиче-ские эффекты полипептидов АРИС1, АРИС2 и АРИС3, имеющих степень идентичности аминокислотной последовательности, равную 92—98%, также значительно различаются [6]. Следует отметить, что АРИС1—АРИС3 способны понижать тепловую чувствительность животных в меньших концентрациях (0.01—0.1 мг/кг) [4, 6, 7].
Нами также обнаружено, что статистически достоверный обезболивающий эффект ИС08 1.36 и 1.10 развивается в течение первых 10— 20 мин и продолжается, по меньшей мере, в течение 1 ч (рис. 2б). Подобная динамика развития
234
ТАБАКМАХЕР и др.
Лятеитный период с
Время, мин
Рис. 2. Анальгетические эффекты рекомбинантных полипептидов на модели тепловой стимуляции боли (тест отдергивания хвоста). (а) — величины анальгетического эффекта полипептидов. (б) — динамика развития анальгетического эффекта полипептидов в течение 1 ч. По оси ординат — время реакции на болевой стимул. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение значений. Объём исследуемых выборок п = 7. Достоверность отличий от контроля определяли тестом Тьюки. * — р < 0.05.
анальгетического действия наблюдается и для полипептидов HCGS 1.19 и 1.20.
В связи с заменами ряда остатков в аминокислотных последовательностях HCGS 1.20 (положения 14, 38, 48) и HCGS 1.19 (положения 9, 12, 14, 38, 48) их первичная структура имеет значительное сходство со структурой ингибиторов се-риновых, аспарагиновых и цистеиновых протеи-наз SHPI-1 и SHPI-2 из Stichodactyla helianthus [13, 14] (рис. 1б). Логично предположить, что исследуемые полипептиды HCGS 1.19 и 1.20 могут обладать аналогичной активностью. С другой стороны, степень гомологии аминокислотной последовательности ингибитора трипсина и химотрипсина, InhVJ, с последовательностью APHC1 составляет 95%, однако показано, что InhVJ не оказывает модулирующего действия на болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 [15]. К сожалению, в настоящее время отсутствуют данные о наличии анальгети-ческой активности у ингибиторов протеиназ Ку-нитц-типа InhVJ, SHPI-1 и SHPI-2.
Проведенный ранее анализ электростатических свойств показал, что HCGS 1.10 и HCGS 1.36 входят в одну группу с анальгетическими полипептидами H. crispa APHC1-APHC3, которые характеризуются точечным распределением зарядов на поверхности молекулы [9]. Полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20, напротив, группируются с явно положительно заряженными полипептидами SHPI-1 и SHPI-2. В рамках предложенной нами модели взаимодействия APHC1 с TRPV1 такой характер распределения заряда препятствует согласно расчетам распознаванию полипептидного лиганда рецептором [9].
Вопре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.