ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 5, с. 617-625
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИИ
УДК 575.11
АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНОГО СОСТАВА ГЕНОВ, СВЯЗАННЫХ С ХЛЕБОПЕКАРНЫМИ КАЧЕСТВАМИ, У АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ ПШЕНИЦЫ © 2013 г. М. В. Климушина1, М. Г. Дивашук1, Т. А. К. Мухаммед2, О. Г. Семенов2, Г. И. Карлов1
1Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, Центр молекулярной
биотехнологии, Москва 127550 e-mail: divashuk@gmail.com 2Российский университет дружбы народов, Москва 117198 Поступила в редакцию 20.07.2012 г.
Проведен скрининг коллекции аллоцитоплазматических гибридов мягкой пшеницы (АЦПГ) на ал-лельное состояние генов, связанных с хлебопекарными качествами (высокомолекулярные глюте-нины, пуроиндолины и Waxy). С помощью набора молекулярных маркеров показана возможная интрогрессия гена Waxy T. timopheevi в геном мягкой пшеницы у ряда образцов АЦПГ. Определены аллельные варианты генов, связанных с хлебопекарными качествами, у 22 образцов АЦПГ и на основании полученных данных выявлены наиболее перспективные образцы как для дальнейших мо-лекулярно-генетических исследований, так и для прикладных целей.
DOI: 10.7868/S0016675813050081
Аллоцитоплазматические гибриды пшеницы (АЦПГ) получают при перемещении ядра Triticum aestivum L. в чужеродную цитоплазму (Secale, Aegilops, а также различных видов Triticum) методом беккроссирования. Линии аллоцитоплазма-тической мягкой пшеницы являются удобным модельным объектом для изучения специфики функциональных взаимодействий генов цитоплазмы с генами ядра и регулирования экспрессии ядерного генома. Кроме того, АЦПГ могут быть ценными источниками генетического материала для увеличения генетического разнообразия и улучшения ряда хозяйственно-ценных свойств мягкой пшеницы. Было показано положительное влияние генов цитоплазмы и ядерно-цитоплазматических взаимодействий на устойчивость к болезням и засухе по сравнению с родительскими формами [1, 2]. Выявлено, что цитоплазма играет важную роль в формировании ка-ротиноидов семени и такие виды, как T. aestivum subesp. macha и Ae. squarrosa, являются ценными донорами цитоплазмы, повышающими содержание каротиноидов [3]. Цитоплазмы таких видов, как Aegilops cylindrica, Ae. ventricosa и Triticum turgi-dum, оказывают положительный эффект на массу тысячи зерен в некоторых гибридных комбинациях, а Ae. cylindrica, Ae. variabilis, Ae. ventricosa и Ae. uniaristata влияют на процесс формирования текстуры эндосперма зерна [4]. У форм мягкой пшеницы, созданных на основе отдаленной гибридизации и замещения пшеничной цитоплазмы, проявивших свою перспективность по различным спектрам устойчивости к биотическим и
абиотическим факторам, практический интерес представляют хлебопекарные качества зерна [5]. Эти качества детерминируются рядом факторов, главными из которых являются количественное и качественное состояние клейковины, соотношение компонентов крахмала и текстура эндосперма зерновки. Главным образом состояние клейковины определяется составом субъединиц высокомолекулярных глютенинов (HMW-GS) [6, 7]. Высокомолекулярные глютенины — это запасные белки эндосперма пшеницы, кодируемые локуса-ми Glu-A1, Glu-B1 и Glu-D1, локализованными на длинных плечах хромосом 1А, 1В и 1D соответственно [8, 9]. Хлебопекарные качества зависят также и от физико-химических свойств крахмала, которые определяются соотношением содержания его компонентов — амилозы и амилопектина. Ключевым ферментом в синтезе амилозы является гранул-связанная синтаза крахмала (GBSSI, или белок Waxy), которую кодируют гены Wx, расположенные в хромосомах 7AS (WX-A1), 4AL (Wx-B1) и 7DS (Wx-D1) [10, 11]. У мягкой пшеницы для каждого из генов Wx было выявлено несколько аллелей: функциональный аллель, или аллель дикого типа (а), кодирующий синтез белка GBSSI; неактивный (b — нуль-аллель), при наличии которого блокируется синтез белка GBSSI, что приводит к снижению содержания амилозы в крахмале; а также ряд функциональных аллелей, отличающихся от аллелей дикого типа [12—15]. Другим фактором, влияющим на качество муки, является текстура эндосперма, от нее зависит качество помола, размер частиц муки, процент по-
вреждения гранул крахмала и водопоглощающая способность муки. Мягкие пшеницы с хорошими хлебопекарными качествами имеют твердозер-ную текстуру эндосперма. За текстуру зерна, т.е. твердость или мягкость эндосперма, ответственны белки пуроиндолин а (PINa) и пуроиндолин b (PINb), кодируемые тесно сцепленными генами Pina-D1 и Pinb-D1, локализованными на коротком плече хромосомы 5D в локусе Ha (Hardness) [16-18].
В настоящее время создана обширная коллекция самофертильных линий аллоцитоплазмати-ческой пшеницы T. aestivum L., сочетающих ядерный геном различных сортов яровой и озимой мягкой пшеницы с цитоплазмой таких видов, как Secale cereale, Aegilops ovata, T. timopheevi. Наиболее перспективные формы проходят конкурсные сортоиспытания, а лучшие из них испытываются в производственных условиях. Такие формы сочетают высокую урожайность, устойчивость к болезням и полеганию, обладают хорошими технологическими свойствами, такими как крупность зерновок. Кроме того, ряд образцов продемонстрировал высокую степень устойчивости к различным типам засухи в естественных условиях [19].
Целью нашей работы был анализ аллельного состава генов, влияющих на хлебопекарные качества, в коллекции наиболее перспективных алло-цитоплазматических гибридов мягкой пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовали 22 аллоцитоплазматических гибрида мягкой пшеницы, созданных О.Г. Семеновым (РУДН) методом межвидовой гибридизации и возвратных скрещиваний (не менее шести беккроссов) с последующим отбором (таблица) [1]. В качестве контролей использовали сорт мягкой пшеницы Hokkai 252 — носитель нуль-аллеля по гену Wx-B1; сорт мягкой пшеницы Сила, имеющий нуль-аллель по гену Wx-A1, и T. timopheevi, донор цитоплазмы у большинства исследуемых образцов АЦПГ.
Выделение ДНК из проростков проводили по методу Bernatzky и Tanksley [20].
Праймеры и условия ПЦР. В работе использовали следующие праймеры на аллельное состояние генов — Glu-A1: UMN19F и UMN19R [21]; Glu-B1: Bx7OEF и Bx7OER [22]; Glu-D1: Dx5F, DxF и DxR [23]; Pina-D1: Pina-D1F и Pina-D1R [24]; Pinb-D1: PinB-D1F и PinB-D1R [24]; Wx-A1: AFC и AR2 [25]; Wx-B1: BDFL и BRD [25]; Wx-B1: Wx-B1L и Wx-B1R [26]; Wx-B1: 4F и 4R [27]; Wx-B1: BDFL, BRC1, BRC2 и BFC [28]; Wx-D1: BDFL и DRSL [25]. Полимеразную цепную реакцию проводили на Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, США) при условиях, рекомендуемых авторами прайме-
ров. 25 мкл реакционной смеси содержали: 1х Taq полимеразный буфер (Силекс, Москва), 1.0 U Taq ДНК полимеразы (Силекс, Москва), 200 мкМ каждого dNTP (Promega), 0.2 мкМ каждого прай-мера и 100—150 нг ДНК матрицы. Концентрация хлорида магния для праймеров PinB-D1F, PinB-D1R, Pina-D1F и Pina-D1R составляла 3.0 мкМ, в остальных случаях — 2.5 мкМ. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буферном растворе (ТВЕ). В качестве маркера размеров использовали "100 bp Ladder" (Fermentas, Литва).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Гены, кодирующие высокомолекулярные субъединицы (ВМС) глютенинов
В работах по сравнению влияния субъединиц высокомолекулярных глютенинов на хлебопекарные качества была разработана балльная система оценок наиболее распространенных ал-лельных вариантов трех локусов, кодирующих ВМС глютенинов [29, 30]. Аллельные варианты Glu-A1a и Glu-A1b, кодирующие субъединицы 1 и 2* соответственно, оказывают положительное влияние на хлебопекарные качества (3 балла), тогда как нуль-аллель имеет оценку 1 балл. При использовании кодоминантного маркера [21], позволяющего идентифицировать аллельные варианты генов ВМС глютенинов, кодируемых локусом Glu-A1, на сортах, имеющих субъединицу 2*, ам-плифицируется фрагмент размером 362 пн. В противном случае наблюдается фрагмент размером 344 пн. Скрининг коллекции АЦПГ на аллельное состояние Glu-A1 гена выявил шесть образцов с фрагментом амплификации размером 362 пн, что соответствует субъединице 2*. 15 образцов имеют альтернативные аллели. Один образец АЦПГ расщеплялся по данному признаку (таблица).
Было доказано, что сверхэкспрессия субъединицы 7, кодируемой геном Glu-B1, связана с увеличением силы теста и хорошими хлебопекарными качествами [22, 31]. Кодоминантный молекулярный маркер [22] позволяет амплифицировать фрагмент региона Bx7OE, находящегося в начале кодирующей области. У всех сортов, имеющих сверхэкспрессию субъединицы 7, амплифициру-ется фрагмент размером 565 пн, в то время как у сортов, не имеющих сверхэкспрессию, наблюдается фрагмент размером 520 пн. При проведении ПЦР с данным молекулярным маркером было выявлено, что на всех образцах изучаемой нами коллекции амплифицировался фрагмент размером 520 пн, что свидетельствует об отсутствии сверхэкспрессии субъединицы 7 (таблица).
Существенное влияние на хлебопекарные качества оказывает аллельное состояние гена Glu-D1 [29, 30]. При наличии субъединиц 5 + 10 (4 балла)
Аллельный состав основных генов, отвечающих за хлебопекарные качества, у аллоцитоплазматических гибридов
и М и н к
Линия А1I III Тип цитоплазмы Глютенины Пуроиндо-лины т-А1 \Vx-Bl \Vx-Dl
«3 О 1 «3 О 1 в к а; О 1 К а; А ГС, А112 13131 I , виз 41; 4 к \Vx-B 1Г, \Vx-B 1Я ВБГГ, ВЫС1, ВЫС2, ВТС ВБИ., П1«1
"а" или "Ь" Отсутст т-А1 "а" или "Ь" отсутст И<х--/1 / ДОП. фрагмент "а" или "Ь" отсутст И<х--/1 / ДОП. фрагмент "а" или "Ь" ДОП. фрагмент "а" или "Ь" "а" или "Ь"
2/09 Т. йторкееу/ гет - 5 + 10 а ь + а + + а + + а + а а
3/09 Т. йторкееу/ - - - а ь + а + + а + + а + а а
4/09 Т. йторкееу/ - - 5 + 10 а ь а а а а а а
7/09 Т. йторкееу/ - - - Ь а а Ь Ь Ь Ь а
9/09 Т. йторкееу1 2* - - а гет гет а а а а а
11/09 Т. йторкееу1 - - 5 + 10 гет Ь + а + + а + + а + а а
12/09 Ае. оуШа - - - Ь а а Ь Ь Ь Ь а
12/10с Т. йторкееу1 2* - - а Ь + а + + а + + а + а а
13/09 Т. йторкееу1 - - - а Ь а а а а а а
14/09 Т. йторкееу1 - - - а Ь а а а а а а
15/09 Т. йторкееу1 - - 5 + 10 а а а а а а а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.