научная статья по теме АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНА ИНСУЛИНАЗЫ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 2 В МОСКОВСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНА ИНСУЛИНАЗЫ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 2 В МОСКОВСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ»

ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 1, с. 127-131

ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

УДК 575:599.9

АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНА ИНСУЛИНАЗЫ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 2

В МОСКОВСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

© 2009 г. П. А. Сломинский1, О. В. Пивоварова1, М. И. Шадрина1, А. В. Артемьева1, Ф. Г. Пфайффер3, Н. Н. Рудович3, С. Э. Агаджанян2, В. С. Пронин2, С. А. Лимборская1

1Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182; e-mail: slomin@img.ras.ru 2Клиника эндокринологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва 119435 3Department of Clinical Nutrition, German Institute of Human Nutrition, Potsdam 14558, and Department of Endocrinology and Nutrition, Campus B. Franklin, Charite University Medicine, Berlin 12200, Germany

Поступила в редакцию 27.06.2007 г. Окончательный вариант получен 14.07.2008 г.

Проведен анализ ассоциации 13 однонуклеотидных полиморфных маркеров гена инсулиназы (IDE) с сахарным диабетом типа 2 (СД типа 2) в московской популяции. Выявлены три полиморфных маркера (rs7078413, rs7899603 и rs551266), ассоциированных с риском развития СД типа 2. Для этих трех маркеров статистически достоверные различия в распределении частот генотипов и аллелей в выборке больных и в контрольной выборке были обнаружены только в группе женщин, в то время как в общей группе частоты генотипов достоверно различались лишь для однонуклеотидного полиморфного маркера rs7078413.

Сахарный диабет - группа метаболических заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом дефектов секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов. Хроническая гипергликемия приводит к тяжелым осложнениям, таким как слепота, почечная недостаточность, инсульт, ампутация конечностей и др. Среди всех форм сахарного диабета до 90% случаев заболевания приходятся на сахарный диабет типа 2 (СД типа 2). Этот тип диабета характеризуется сочетанием дисфункции панкреатических бета-клеток и пониженной чувствительности периферических клеток к действию инсулина [1].

По данным ВОЗ, в настоящее время заболеваемость СД типа 2 носит характер неинфекционной эпидемии. Число заболевших СД типа 2 в мире удваивается каждые 12-15 лет и к 2025 г. будет составлять более 300 млн. человек.

Этиология комплексного (полигенного) СД типа 2 включает как влияние факторов среды, так и генетические факторы. В последние годы возможное влияние на риск развития СД типа 2 было исследовано для большого числа генов, принадлежащих к различным семействам и метаболическим путям (в частности, участвующих в развитии и функциях бета-клеток, адипоцитов и гепатоцитов, в инсулиновом сигнальном пути или гипоталамической регуляции), однако лишь для нескольких из них оно было доказано [2].

Ряд литературных данных позволяет предположить, что ген инсулиназы (IDE) - один из веро-

ятных генов-кандидатов, участвующих в развитии СД типа 2. IDE представляет собой содержащую цинк протеиназу, расположенную преимущественно в цитозоле. Главным субстратом IDE является инсулин, хотя инсулиназа способна также расщеплять ряд других субстратов: глюкагон, атриальный натрийуретический пептид, трансформирующий фактор роста альфа (TGFa) и др. Все чувствительные к действию инсулина клетки содержат IDE, но этот фермент также присутствует и в нечувствительных к инсулину тканях, что позволяет предположить множественность его функций в клетке.

Локус 10q23-q25, где расположен ген IDE, сцеплен с риском возникновения СД типа 2, а также с уровнем глюкозы, отношением уровня инсулина к уровню глюкозы в плазме крови натощак и уровнем гликозилированного гемоглобина А (HbA1c) [3-5]. Полиморфизм в гене Ide ассоциирован с возникновением СД типа 2 у крыс линии Goto-Kakizaki (GK) со спонтанным развитием сахарного диабета [6]. Для нокаутных мышей Ide -/характерны пониженный уровень деградации инсулина, гиперинсулинемия и нарушенная толерантность к глюкозе - классические признаки СД типа 2.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что полиморфизм гена IDE может влиять на обмен инсулина у человека. Однако разультаты анализа полиморфных маркеров гена IDE в различных популяциях человека противоречивы. Убедительные доказательства ассоциации поли-

Таблица 1. Полиморфные маркеры гена инсулиназы (IDE)

dbSNP rsID Локализация Аллели Методы генотипирования

rs2209972 [8] 3UTR C/T ПДРФ/HgaI

rs11187007 Итрон 24 A/G ПДРФ/MvaI

rs12356364 Экзон 23 C/T ПДРФ/LweI

rs551266 [7] Итрон 21 A/G ПДРФ/BsmAI

rs1887922 [7, 8] Итрон 20 C/T TaqMan ПЦР

rs7899603 Итрон 20 C/G ПДРФ/BfI

rs2250090 [7] Итрон 17 A/G TaqMan ПЦР

rs2149632 [8] Итрон 17 C/T ПДРФ/М

rs2249960 [7] Итрон 17 A/G ПДРФ/BsrI

rs5030982 Экзон 15 G/T ПДРФ/BsiXI

rs11187039 Экзон 6 A/G ПДРФ/Fafl

rs7078413 Итрон 4 A/C ПДРФ/^spI

rs11187060 Итрон 1 C/T ПДРФ/ftrI

морфизма гена IDE с риском развития СД типа 2 и с уровнем инсулина и глюкозы в плазме крови получены в некоторых популяциях европейского происхождения (у шведов и англоамериканцев в рамках Framingham Heart Study) [7, 8]. В то же время подобные ассоциации не были обнаружены в других популяциях [9, 10].

Все это требует проведения новых исследований ассоциации ДНК-маркеров из области гена IDE в разных этнических группах, в связи с чем целью настоящего исследования стал поиск возможной ассоциации однонуклеотидных полиморфных маркеров гена IDE с развитием СД типа 2 в московской популяции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали 13 однонуклеотидных полиморфных маркеров (ОНП), расположенных как в экзонах и интронах, так и в З'-нетранслируемой области гена IDE. В исследование были включены как ОНП, для которых выявлена ассоциация с риском развития СД типа 2 и/или корреляция со степенью выраженности характерных для этого заболевания клинических признаков в других популяциях [7, 8], так и ранее не анализировавшиеся при СД типа 2 ОНП. Список и локализация изученных генетических маркеров представлены в табл. 1. ОНП исследовали у 102 больных СД типа 2 из г. Москвы и в контрольной выборке, состоящей из 102 здоровых человек и соответствующей по возрасту, полу и этнической принадлежности группе больных. Подбор и клиническое обследование пациентов проводилось на базе Клиники эндокринологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Для проведения молекулярно-генетического анализа были использованы препараты ДНК, полученные из 5-10 мл венозной крови. ДНК выделяли стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование осуществлялось методами изучения полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ) и аллельной дискриминации с помощью 5'-нуклеазного (TaqMan) анализа.

Метод ПДРФ заключался в ПЦР-амплифика-ции фрагмента, содержащего ОНП, и его последующем расщеплении соответствующей рестрик-тазой (табл. 1). Смесь для амплификации, объемом 20 мкл, содержала 5пМ каждого праймера, 2 мкл 10 х ПЦР-буфера (750 мМ трис-HCl (pH 8.8), 200мМ (NH4)2SO4, 0.1% твин 20), 2.5 мМ MgCl2, 1 мМ каждого dNTP, 1 ед. полимеразы Taq ("Syntol", Москва) и 0.1-0.2 мкг геномной ДНК. Идентификация рестриктазных фрагментов осуществлялась при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый эти-дий (0.5 мг/мл), с визуализацией фрагментов в проходящем УФ-свете. Праймеры и условия амплификации могут быть предоставлены всем заинтересованным лицам по их запросу.

Дизайн праймеров и зондов для TaqMan-анали-за был выполнен фирмой "Applied Biosystems" (http://www.appliedbiosystems.com). Аллель-специфические зонды были мечены флуорофорами ROX или FAM на 5'-конце и несли гаситель флуоресценции BHQ2 или RTQ1 на З'-конце.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ "GraphPad InStat 3" и "Statistica 7.0". Достоверность различий частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в сравниваемых группах определяли с помощью критерия %2. Достоверным считали уровень значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате генотипирования 13 полиморфных маркеров гена IDE ни у одного из больных не было выявлено минорного аллеля для трех ОНП -rs11187039, rs5030982 и rs12356364. Эти ОНП были исключены из дальнейшего анализа. Для остальных полиморфизмов в контрольной группе распределение генотипов соответствoвало закону Харди-Вайнберга.

Статистически достоверные различия в распределении частот генотипов в группе больных и в контрольной группе были выявлены лишь для полиморфизма rs7078413 (замена A на C в интро-не 4 гена IDE) (%2 = 7.933, p = 0.019). Частоты генотипов и аллелей полиморфного маркера rs7078413 представлены в табл. 2. Как в группе больных, так и в контрольной группе с наибольшей частотой встречался генотип AA. Интересно,

Таблица 2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров гена IDE в группе больных СД типа 2 и контрольной группе

Полиморф- Варианты гено- Контрольная группа Больные СД типа 2 х2 Р

ные маркеры типов и аллелей N = 102 Частота, % N = 102 Частота, %

rs7078413 AA 27 26.5 38 37.3

AC 56 54.9 36 35.3 7.933 0.019

CC 19 18.6 28 27.5

A C 110 27 53.9 26.5 112 38 54.9 37.3 0.010 0.921

rs7899603 CC 25 24.5 24 23.5

GC 57 55.9 45 44.1 4.621 0.099

GG 20 19.6 33 32.4

C G 107 97 52.5 47.5 93 111 45.6 54.4 1.658 0.198

rs551266 AA 72 71.28 64 62.7

GA 28 27.71 33 32.4 3.542 0.170

GG 1 0.01 5 4.9

A G 172 30 85.1 14.9 161 43 78.9 21.1 2.263 0.133

что в группе больных наблюдалось снижение частоты гетерозиготных генотипов (на 19.6%) по сравнению с контрольной группой, в то время как частоты гомозигот АА и СС повышались на 10.8 и 8.9% соответственно. При этом частоты аллеля А и аллеля С в обеих группах практически не различались (х2 = 0.010, p = 0.921). Относительный риск развития СД типа 2 у носителей гетерозиготного генотипа по полиморфному маркеру rs7078413 был понижен в 0.67 раза (OR = 0.67; CI = 0.51-0.89). Полученные нами статистически достоверные данные о наличии ассоциации между полиморфным маркером rs7078413 и СД типа 2 являются принципиально новыми.

Сравнение частот генотипов в группе больных и в контрольной группе среди женщин позволило выявить ассоциацию большего количества полиморфных маркеро

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком