МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 682-693
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8
АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ДВУХ ЭНДЕМИЧНЫХ
ВИДОВ ГУБОК ИЗ ОЗЕРА БАЙКАЛ
© 2014 г. А. С. Гладких*, Ок. В. Калюжная*, О. И. Белых*, Т. С. Ан**, В. В. Парфенова*
*Лимнологический институт СО Российской академии наук, Иркутск **Кангвонский Национальный университет, Чунчон, Республика Корея Поступила в редакцию 17.10.2013 г.
Изучено бактериальное разнообразие двух эндемичных губок из оз. Байкал, характеризующихся разными жизненными формами: ветвистой ЬыЬотшЫа Ьа1са1вт1$ и корковой Бшка1о$рощ1а 8р. Впервые для анализа бактериальных сообществ пресноводных губок применен метод 454 пиросе-квенирования фрагментов генов 168 рРНК. В составе ассоциированного сообщества ЬыЬотшЫа Ьа1са1вт1$ идентифицировано 426 ОТИ, в составе Ба1ка1о5рощ1а 8р. — 428 ОТИ. В целом в микробных ассоциациях исследованных губок идентифицировано 24 бактериальных филума, среди которых доминировали представители Бacteroidetes, Рго(еоЬас(епа и ЛсйпоЬас(егча. Анализ таксономического состава бактериальных сообществ губок проведен путем поиска доминирующих филотипов в кластерах уровня филума. Сравнение бактериальных ассоциаций губок и байкальского бактерио-планктона выявило наличие в сообществах как общих, так и уникальных ОТИ, характерных для исследованных видов губок.
Ключевые слова: озеро Байкал, пиросеквенирование, 16S рРНК, эндемичные губки, Lubomirskia baicalensis, Baikalospongia sp.
DOI: 10.7868/S0026365614060068
Губки (тип Porifera) привлекают внимание исследователей благодаря способности аккумулировать в своем теле разнообразные микроорганизмы, такие как гетеротрофные бактерии, цианобакте-рии, микроскопические водоросли, археи, дино-флагелляты, грибы и т.д. Эти прикрепленные к бентосным субстратам, фильтрующие воду животные, способны прокачивать в день до 24000 л воды на 1 кг массы тела [1]. Часть планктонных микроорганизмов, проходящих вместе с водой через систему каналов в теле губки, используется в качестве пищевого ресурса, а часть аккумулируется и формирует симбиотическое сообщество губки. Для некоторых видов губок микроорганизмы могут составлять до 35% биомассы всего сообщества, участвуя в процессах фотосинтеза, фиксации углерода, трансформации азота, анаэробного метаболизма, а также выполняя защитные функции [2]. Многие вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами губок, находят медицинское и биотехнологическое применение [3]. Неудивительно, что микробные сообщества губок на протяжении более 30 лет являются объектом изучения во всем мире, при этом до недавнего времени исследования затрагивали в основном сообщества морских губок, разнообразие ко-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gladkikh@lin.irk.ru).
торых превышает 8000 видов [1, 4]. Ассоциации микроорганизмов пресноводных губок (Роп/ега, Haplosclerida, Spongillina), до сих пор остаются крайне малоизученными. Вместе с тем пресноводная спонгиофауна включает более 150 видов, населяющих разнообразные по экологическим условиям места обитания: озера, реки, ручьи, заливы, водные резервуары и т.п. [5].
На сегодняшний день с применением пиросе-квенирования проведен анализ симбиотических ассоциаций 32 видов морских губок. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в этих сообществах представлено 28 бактериальными фи-лумами, двумя филумами архей, несколькими группами микроводорослей и грибов [4]. Анализ образцов морских губок выявил, что 70—96% последовательностей принадлежат бактериям, в то время как в воде этот показатель достигает 99% [6]. Разнообразие микробных сообществ пресноводных губок к настоящему времени освещено лишь в нескольких работах [7—10]. В ранних исследованиях микробные ассоциации изучали путем создания библиотек 168 рРНК и дальнейшего секвенирования классическим методом Сенгера. В общей сложности в составе микробиомов пресноводных губок было выявлено 9 бактериальных филумов: ЛсипоЬа^Иа, ProteoЬacteria, Verrыcomi-
crobia, Bacteroidetes, Planctomycetes, Cyanobacteria, Chloroflexi и Nitrospirae, а также филум ТМ7, представленный некультивируемыми бактериями.
В данной работе мы использовали метод пиро-секвенирования фрагмента гена 168 рРНК с целью изучения разнообразия бактериальных сообществ двух видов губок эндемичного семейства Lubomirskiidae из озера Байкал — самого древнего и глубокого озера на планете. Образцы губок, использованные в данном исследовании, принадлежат разным родам и характеризуются различными жизненными формами: ветвистая губка Lubomirskia baicalensis и корковая Baikalo-spongia Бр. Ассоциированные сообщества губок сравнивали с сообществом бактериопланктона оз. Байкал.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор проб. Образцы губок Lubomirskia baicalen-sis и Baikalospongia sp. были собраны в июне 2010 г. в ходе экспедиционных работ в районе пос. Большие Коты (юго-западное побережье оз. Байкал) с глубины 10—15 м с помощью водолазной техники. Одновременно были отобраны пробы бактерио-планктона [11].
Пиросеквенирование. Суммарную ДНК из образцов губок и бактериопланктона выделяли немедленно после отбора проб с помощью набора "ДНК-Сорб В" ("ИнтерЛабСервис", Россия). Амплификацию проводили, используя эубакте-риальные праймеры 9F и 541R, фланкирующие участок V1-V3 гена 16S рРНК [12]. Помимо бактериальных, выбранная пара праймеров ампли-фицирует гены 16S рРНК в хлоропластах высших водорослей [15]. Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на пиро-секвенаторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium компанией "ChunLab Inc." (Национальный университет г. Сеул, Республика Корея). Максимальная длина полученных последовательностей составила 510 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов были исключены из анализа. Таким образом, каждая из последовательностей включала, по меньшей мере, два из трех (V1, V2 и V3) гипервариабельных участков гена 16S рРНК.
Анализ разнообразия и таксономического состава сообществ. Каждая полученная в ходе пиросекве-нирования последовательность была таксономи-чески идентифицирована путем сравнения с последовательностями базы данных EzTaxon-e [13], используя алгоритмы BLASTN поиска и попарное сравнение. Для идентификации применяли следующие пороги сходства (х = сходство): виды (x > > 97%), роды (97 > x > 94%), семейства (94 > x > 90%), порядки (90 > x > 85%), классы (85 > x > 80%), филум (80 > x > 75%).
Первичный анализ данных пиросеквенирова-ния, удаление коротких и химерных последовательностей, кластеризацию в OTU (operational taxonomic units), оценку биоразнообразия путем расчета индексов ACE, Chao1 и Шеннона, построение диаграммы Венна проводили с помощью программного пакета Mothur v. 1.32.1 (http:// www.mothur.org). Для определения видового разнообразия, таксономического состава и сравнения сообществ применяли пакет программ Py-rosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Полученные последовательности выравнивали и проводили кластерный анализ с помощью программы Complete Linkage Clustering, входящей в состав Pyrosequencing pipeline. Кластеризацию осуществляли на разных уровнях, характеризующихся различными расстояниями между кластерами (от 0 до 0.1 с шагом 0.01). Выделение фило-типов (OTU) проводили при кластерном расстоянии 0.03; оценку таксономической сложности сообществ — на разных уровнях сходства, соответствующих следующим таксонам: вид — 0.03, род — 0.05, семейство — 0.1, используя программу Rarefaction (Pyrosequencing pipeline). Для характеристики таксономического состава сообществ проведен кластерный анализ с параметром расстояния 0.3, что на таксономическом уровне соответствует филуму. Для каждого кластера с помощью программы Dereplicate Request (Pyrose-quencing pipeline) выбирали репрезентативную нуклеотидную последовательность, соответствующую центру кластера, имеющую минимальную сумму квадратов расстояний до других входящих в кластер последовательностей. Классификация видов на всех этапах работы произведена на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). На основании процента сходства с последовательностью валидированного микроорганизма кластер относили к соответствующему таксону (от вида до филума) в соответствии с пределами сходства приведенными выше.
Массивы последовательностей, полученные в данной работе, депонированы в NCBI под номером SRP020221.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая характеристика разнообразия в бактериальных сообществах байкальских губок. В составе бактериального сообщества ветвистой губки L. baicalensis в результате пиросеквенирования выявлена 7071 последовательность гена 16S рРНК длиной более 300 нуклеотидов, из них 6873 последовательностей принадлежали домену Bacteria (2935 — уникальных), 298 — домену Eukarya. Общая длина анализируемых бактериальных последовательностей составила 3000660 нуклеотидов,
Последовательности
Рис. 1. Кривые Rarefaction на различных уровнях кластерного расстояния.
средняя — 470 нуклеотидов. Число выявленных филотипов составило 426.
В сообществе корковой губки Baikalospongia sp. выявлено 7042 последовательности гена 16S рРНК длиной более 300 нуклеотидов, из них 6817 — принадлежали домену Bacteria (2601 — уникальных), 225 — домену Eukarya. Общая длина анализируемых бактериальных последовательностей составила 2931465 нуклеотидов, средняя — 470 нуклеотидов, число OTU — 428.
Среди эукариот были отмечены генотипы 16S рРНК хлоропластов зеленых и диатомовых водорослей с преобладанием рода Chlorella.
Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью построения кривых Rarefaction, иллюстрирующих зависимость числа детектированных OTU от числа проанализированных последовательностей для различных уровней сходства нуклеотидных последовательностей. Кривые накопления видов (как при анализе сообщества L. baicalensis, так и Baikalospongia sp.) при увеличении числа анализируемых последовательностей не выходили на плато, а число выявленных OTU к концу анализа увеличивалось линейно (рис. 1). Представленные кривые показывают, что достигнутый в настоящей рабо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.