научная статья по теме АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ДВУХ ЭНДЕМИЧНЫХ ВИДОВ ГУБОК ИЗ ОЗЕРА БАЙКАЛ Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ДВУХ ЭНДЕМИЧНЫХ ВИДОВ ГУБОК ИЗ ОЗЕРА БАЙКАЛ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 682-693

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.8

АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ДВУХ ЭНДЕМИЧНЫХ

ВИДОВ ГУБОК ИЗ ОЗЕРА БАЙКАЛ

© 2014 г. А. С. Гладких*, Ок. В. Калюжная*, О. И. Белых*, Т. С. Ан**, В. В. Парфенова*

*Лимнологический институт СО Российской академии наук, Иркутск **Кангвонский Национальный университет, Чунчон, Республика Корея Поступила в редакцию 17.10.2013 г.

Изучено бактериальное разнообразие двух эндемичных губок из оз. Байкал, характеризующихся разными жизненными формами: ветвистой ЬыЬотшЫа Ьа1са1вт1$ и корковой Бшка1о$рощ1а 8р. Впервые для анализа бактериальных сообществ пресноводных губок применен метод 454 пиросе-квенирования фрагментов генов 168 рРНК. В составе ассоциированного сообщества ЬыЬотшЫа Ьа1са1вт1$ идентифицировано 426 ОТИ, в составе Ба1ка1о5рощ1а 8р. — 428 ОТИ. В целом в микробных ассоциациях исследованных губок идентифицировано 24 бактериальных филума, среди которых доминировали представители Бacteroidetes, Рго(еоЬас(епа и ЛсйпоЬас(егча. Анализ таксономического состава бактериальных сообществ губок проведен путем поиска доминирующих филотипов в кластерах уровня филума. Сравнение бактериальных ассоциаций губок и байкальского бактерио-планктона выявило наличие в сообществах как общих, так и уникальных ОТИ, характерных для исследованных видов губок.

Ключевые слова: озеро Байкал, пиросеквенирование, 16S рРНК, эндемичные губки, Lubomirskia baicalensis, Baikalospongia sp.

DOI: 10.7868/S0026365614060068

Губки (тип Porifera) привлекают внимание исследователей благодаря способности аккумулировать в своем теле разнообразные микроорганизмы, такие как гетеротрофные бактерии, цианобакте-рии, микроскопические водоросли, археи, дино-флагелляты, грибы и т.д. Эти прикрепленные к бентосным субстратам, фильтрующие воду животные, способны прокачивать в день до 24000 л воды на 1 кг массы тела [1]. Часть планктонных микроорганизмов, проходящих вместе с водой через систему каналов в теле губки, используется в качестве пищевого ресурса, а часть аккумулируется и формирует симбиотическое сообщество губки. Для некоторых видов губок микроорганизмы могут составлять до 35% биомассы всего сообщества, участвуя в процессах фотосинтеза, фиксации углерода, трансформации азота, анаэробного метаболизма, а также выполняя защитные функции [2]. Многие вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами губок, находят медицинское и биотехнологическое применение [3]. Неудивительно, что микробные сообщества губок на протяжении более 30 лет являются объектом изучения во всем мире, при этом до недавнего времени исследования затрагивали в основном сообщества морских губок, разнообразие ко-

1 Автор для корреспонденции (e-mail: gladkikh@lin.irk.ru).

торых превышает 8000 видов [1, 4]. Ассоциации микроорганизмов пресноводных губок (Роп/ега, Haplosclerida, Spongillina), до сих пор остаются крайне малоизученными. Вместе с тем пресноводная спонгиофауна включает более 150 видов, населяющих разнообразные по экологическим условиям места обитания: озера, реки, ручьи, заливы, водные резервуары и т.п. [5].

На сегодняшний день с применением пиросе-квенирования проведен анализ симбиотических ассоциаций 32 видов морских губок. Филогенетическое разнообразие микроорганизмов в этих сообществах представлено 28 бактериальными фи-лумами, двумя филумами архей, несколькими группами микроводорослей и грибов [4]. Анализ образцов морских губок выявил, что 70—96% последовательностей принадлежат бактериям, в то время как в воде этот показатель достигает 99% [6]. Разнообразие микробных сообществ пресноводных губок к настоящему времени освещено лишь в нескольких работах [7—10]. В ранних исследованиях микробные ассоциации изучали путем создания библиотек 168 рРНК и дальнейшего секвенирования классическим методом Сенгера. В общей сложности в составе микробиомов пресноводных губок было выявлено 9 бактериальных филумов: ЛсипоЬа^Иа, ProteoЬacteria, Verrыcomi-

crobia, Bacteroidetes, Planctomycetes, Cyanobacteria, Chloroflexi и Nitrospirae, а также филум ТМ7, представленный некультивируемыми бактериями.

В данной работе мы использовали метод пиро-секвенирования фрагмента гена 168 рРНК с целью изучения разнообразия бактериальных сообществ двух видов губок эндемичного семейства Lubomirskiidae из озера Байкал — самого древнего и глубокого озера на планете. Образцы губок, использованные в данном исследовании, принадлежат разным родам и характеризуются различными жизненными формами: ветвистая губка Lubomirskia baicalensis и корковая Baikalo-spongia Бр. Ассоциированные сообщества губок сравнивали с сообществом бактериопланктона оз. Байкал.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Отбор проб. Образцы губок Lubomirskia baicalen-sis и Baikalospongia sp. были собраны в июне 2010 г. в ходе экспедиционных работ в районе пос. Большие Коты (юго-западное побережье оз. Байкал) с глубины 10—15 м с помощью водолазной техники. Одновременно были отобраны пробы бактерио-планктона [11].

Пиросеквенирование. Суммарную ДНК из образцов губок и бактериопланктона выделяли немедленно после отбора проб с помощью набора "ДНК-Сорб В" ("ИнтерЛабСервис", Россия). Амплификацию проводили, используя эубакте-риальные праймеры 9F и 541R, фланкирующие участок V1-V3 гена 16S рРНК [12]. Помимо бактериальных, выбранная пара праймеров ампли-фицирует гены 16S рРНК в хлоропластах высших водорослей [15]. Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на пиро-секвенаторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium компанией "ChunLab Inc." (Национальный университет г. Сеул, Республика Корея). Максимальная длина полученных последовательностей составила 510 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов были исключены из анализа. Таким образом, каждая из последовательностей включала, по меньшей мере, два из трех (V1, V2 и V3) гипервариабельных участков гена 16S рРНК.

Анализ разнообразия и таксономического состава сообществ. Каждая полученная в ходе пиросекве-нирования последовательность была таксономи-чески идентифицирована путем сравнения с последовательностями базы данных EzTaxon-e [13], используя алгоритмы BLASTN поиска и попарное сравнение. Для идентификации применяли следующие пороги сходства (х = сходство): виды (x > > 97%), роды (97 > x > 94%), семейства (94 > x > 90%), порядки (90 > x > 85%), классы (85 > x > 80%), филум (80 > x > 75%).

Первичный анализ данных пиросеквенирова-ния, удаление коротких и химерных последовательностей, кластеризацию в OTU (operational taxonomic units), оценку биоразнообразия путем расчета индексов ACE, Chao1 и Шеннона, построение диаграммы Венна проводили с помощью программного пакета Mothur v. 1.32.1 (http:// www.mothur.org). Для определения видового разнообразия, таксономического состава и сравнения сообществ применяли пакет программ Py-rosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Полученные последовательности выравнивали и проводили кластерный анализ с помощью программы Complete Linkage Clustering, входящей в состав Pyrosequencing pipeline. Кластеризацию осуществляли на разных уровнях, характеризующихся различными расстояниями между кластерами (от 0 до 0.1 с шагом 0.01). Выделение фило-типов (OTU) проводили при кластерном расстоянии 0.03; оценку таксономической сложности сообществ — на разных уровнях сходства, соответствующих следующим таксонам: вид — 0.03, род — 0.05, семейство — 0.1, используя программу Rarefaction (Pyrosequencing pipeline). Для характеристики таксономического состава сообществ проведен кластерный анализ с параметром расстояния 0.3, что на таксономическом уровне соответствует филуму. Для каждого кластера с помощью программы Dereplicate Request (Pyrose-quencing pipeline) выбирали репрезентативную нуклеотидную последовательность, соответствующую центру кластера, имеющую минимальную сумму квадратов расстояний до других входящих в кластер последовательностей. Классификация видов на всех этапах работы произведена на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). На основании процента сходства с последовательностью валидированного микроорганизма кластер относили к соответствующему таксону (от вида до филума) в соответствии с пределами сходства приведенными выше.

Массивы последовательностей, полученные в данной работе, депонированы в NCBI под номером SRP020221.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика разнообразия в бактериальных сообществах байкальских губок. В составе бактериального сообщества ветвистой губки L. baicalensis в результате пиросеквенирования выявлена 7071 последовательность гена 16S рРНК длиной более 300 нуклеотидов, из них 6873 последовательностей принадлежали домену Bacteria (2935 — уникальных), 298 — домену Eukarya. Общая длина анализируемых бактериальных последовательностей составила 3000660 нуклеотидов,

Последовательности

Рис. 1. Кривые Rarefaction на различных уровнях кластерного расстояния.

средняя — 470 нуклеотидов. Число выявленных филотипов составило 426.

В сообществе корковой губки Baikalospongia sp. выявлено 7042 последовательности гена 16S рРНК длиной более 300 нуклеотидов, из них 6817 — принадлежали домену Bacteria (2601 — уникальных), 225 — домену Eukarya. Общая длина анализируемых бактериальных последовательностей составила 2931465 нуклеотидов, средняя — 470 нуклеотидов, число OTU — 428.

Среди эукариот были отмечены генотипы 16S рРНК хлоропластов зеленых и диатомовых водорослей с преобладанием рода Chlorella.

Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью построения кривых Rarefaction, иллюстрирующих зависимость числа детектированных OTU от числа проанализированных последовательностей для различных уровней сходства нуклеотидных последовательностей. Кривые накопления видов (как при анализе сообщества L. baicalensis, так и Baikalospongia sp.) при увеличении числа анализируемых последовательностей не выходили на плато, а число выявленных OTU к концу анализа увеличивалось линейно (рис. 1). Представленные кривые показывают, что достигнутый в настоящей рабо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком