ш
УДК 577.112
АНАЛИЗ БЕЛКОВЫХ ПАРТНЕРОВ БЕЛКА ЯДРЫШКА ЧЕЛОВЕКА SURF6 В КЛЕТКАХ HeLa МЕТОДОМ АФФИННОЙ АДСОРБЦИИ
© 2014 г. М. Ю. Кордюкова, М. А. Ползиков, К. В. Шишова, О. В. Зацепина#
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 30.09.2013 г. Принята к печати 24.02.2014 г.
Белки семейства SURF6 — это эволюционно-консервативные белки "домашнего хозяйства" эука-риот, однако функциональное значение SURF6 человека и его белковые партнеры до сих пор не установлены. В настоящей работе для ответа на эти вопросы мы использовали метод аффинной адсорбции (GST pull-down), а в качестве акцепторов — слитые с глутатион^-трансферазой (GST) ре-комбинантный SURF6 человека и рекомбинантный консервативный С-концевой домен Surf6 мыши (Surf6-dom мыши), имеющий 85% подобия с С-консервативным доменом SURF6 человека. Результаты работы показали, что GST-SURF6 в клетках человека HeLa взаимодействует c факторами процессинга рРНК (В23/нуклеофозмином, нуклеолином, EBP2), а также с кофактором РНК-поли-меразы I, белком UBF. Эти же белковые партнеры связывались с GST-Surf6-dom. Данные наблюдения являются первыми экспериментальными свидетельствами в пользу участия SURF6 человека в биогенезе рибосом, включая транскрипцию рДНК и процессинг рРНК. Набор белковых партнеров GST-Surf6-dom в клетках HeLa указывает, кроме того, на возможное взаимодействие SURF6 человека c ядрышковыми и ядерными белками других функциональных групп, т.е. на его многофункциональность.
Ключевые слова: SURF6, биогенез рибосом, ядрышко. DOI: 10.7868/S013234231404006X
ВВЕДЕНИЕ
Белки SURF6 впервые объединены в семейство в 2005 г. на основании анализа аминокислотных последовательностей белков организмов разных видов, от дрожжей до человека [1]. Семейство получило свое название по названиям его главных представителей — белков Surf6 мыши [2] и SURF6 человека [3]. Поскольку у человека и мыши эти белки кодируются последними, шестыми генами входящими в состав локуса surfeit, белки других видов, отнесенные к семейству SURF6, называют также "surfeit locus proteins 6". На сегодняшний день члены семейства выявлены у представителей таких таксономических групп, как грибы [4—6], насекомые [7], рыбы [8], амфибии [9], птицы [10], млекопитающие (включая человека) [2, 3, 11—13], а также у высших растений [14].
Основным систематическим признаком белков семейства SURF6 является наличие консервативного домена, расположенного в С-концевой области молекул (SURF6-dom) и занимающего,
Сокращения: PMSF — фенилметилсульфонилфлуорид, IPTG — изопропилтиогалактозид, DTT — дитиотреитол, GST — глутатион^-трансфераза; рРНК и рДНК — рибосо-мальные РНК и ДНК. # Автор для связи (тел.: +7 (495) 779-23-66; факс: +7 (495) 779-23-66; e-mail: zatsepina_olga@mail.ru).
как правило, более половины последовательности белка (от 182 до 217 а.о.). Степень подобия аминокислотных последовательностей консервативных доменов SURF6 у разных видов составляет около 40%, но у млекопитающих она значительно выше. Так, рассчитанная идентичность аминокислотных остатков SURF6-домена человека и мыши составляет 79%, а степень подобия — 85% (рис. 1). Высказано предположение, что аминокислотные остатки, составляющие домен, могут играть важную роль в фолдинге SURF6 и его взаимодействии с другими белками in vivo [1]. ^-концевая область белков SURF6 у разных видов, напротив, сильно варьирует по длине, а в ее пределах не обнаружено подобия ни между белками-членами SURF6-семейства, ни с другими известными белковыми последовательностями.
К другим признакам семейства белков SURF6 относятся сравнительно небольшие размеры (у мыши и человека 355 и 361 а.о. соответственно), обогащенность остатками лизина и аргинина, которые придают белкам большой положительный заряд (pI около 10.5), отсутствие каких-либо кон-сенсусных функциональных последовательностей, а также преимущественная ядрышковая локализация. У человека экспрессия гена SURF6 описана в тканях всех органов, использованных
H. sapiens (135-351/361) M. musculus (133-345/355)
40 АВК| iVftE
ПТ IKE^PVi
АТР-РК---
-EGnCTEPRpP ---HACK ELBE s'
КЕРР^^Ш
67 63
H. sapiens (135-351/361) M. musculus (133-345/355)
■HBi
«амидами
141 137
H. sapiens (135-351/361) M. musculus (133-345/355)
■WEKRJ И VVEKMQQRQD ^RRQMLa1" glir : 217
¡WEKEL; у VVEKMQQRQD jKKQHLR, •.225232?. ►••2»2: S-'.'З : 213
Рис. 1. Сравнение аминокислотных последовательностей консервативных С-концевых доменов SURF6 человека (H. sapiens) и мыши (M. musculus). В скобках указаны положения доменов и общее количество аминокислотных остатков в молекуле SURF6 каждого вида. Черным и серым цветами выделены идентичные и гомологичные аминокислотные остатки, соответственно. Цифрами и звездочками указаны положения аминокислотных остатков, начиная с первого аминокислотного остатка домена SURF6. Идентификационные номера аминокислотных последовательностей белков семейства SURF6 для доступа в базе данных GeneBank: AF186772 (H.. sapiens) и X92842 (M. musculus).
80
для анализа: поджелудочной железе, почке, мышцах, печени, легком, плаценте, мозге и сердце [3]. Экспериментальным путем доказано, что истощение пула белка 8иЯБ6 у дрожжей [5, 6], в соматических клетках [15] и эмбрионах [16] мыши приводит к гибели клеток. Эти данные позволяют рассматривать белки семейства 8иЯБ6 как эво-люционно-консервативные и жизненно-необходимые белки "домашнего хозяйства" эукариот.
Поскольку основным местом локализации ВиЯБб у разных видов является ядрышко [17, 18], высказано предположение, что их основной функцией является участие в биогенезе рибосом. Однако изучение дрожжевого 8иЯБ6, белка Ягр14, показало, что этот белок многофункционален и необходим не только для сборки субъединиц рибосомы и процессинга рРНК, но также для поляризации и деления клеток [5, 6].
Функции и свойства белков 8иЯБ6 у многоклеточных организмов, включая млекопитающих и человека, на сегодняшний день остаются невыясненными. Установлено лишь, что истощение пула мРНК 8иг16 путем РНК-интерференции приводит к аномалиям процессинга рРНК и снижению содержания рРНК в зародышах мыши [16]. В культивируемых фибробластах мыши истощение пула 8иг16 вызывает накопление клеток в 00- и 01-периодах клеточного цикла [15]. Повышенный уровень экспрессии гена 8и&¥6, не коррелирующий с уровнем экспрессии генов других яд-рышковых белков, описан в эмбриональных стволовых клетках [19, 20], а также в лимфоцитах мыши и человека, активированных к пролиферации [21, 22]. Ген человека относится к генам, экс-
прессия которых изменяется при канцерогенезе и опухолевой прогрессии [23—26]. В совокупности эти наблюдения указывают на многофункциональность не только белка Ягр14 дрожжей, но белков 8иЯБ6 млекопитающих, в том числе и человека.
Одним из подходов к изучению функциональной значимости белков является анализ их белко-
вых партнеров. В настоящей работе для анализа белковых партнеров SURF6 человека использовали сшитые с глутатион^-трансферазой (GST) белки -SURF6 человека и консервативный С-концевой домен Surf6 мыши (Surf6-dom), получаемые экспрессией двух соответствующих плазмид. Использование GST-Surf6-dom мыши обусловлено высокой степенью его подобия (85%) с SURF6-dom человека (рис. 1). GST-SURF6 и GST-Surf6-dom использовали в качестве акцепторов для выявления их белковых партнеров в ядерных экстрактах клеток HeLa методом аффинной адсорбции (GST pull-down).
Белки, связавшиеся с GST-SURF6, после элек-трофоретического разделения идентифицировали на иммуноблотах с использованием антител к ключевым факторам биогенеза рибосом, а белки, связавшиеся с GST-Surf6-dom, - еще и методом масс-спектрометрии. Полученные результаты показали, что в клетках HeLa белковыми партнерами SURF6 человека являются, по крайней мере, три основных фактора процессинга рРНК (В23/нук-леофозмин, нуклеолин, EBP2), а также специфический кофактор РНК-полимеразы I, белок UBF. Это говорит об участии SURF6 в транскрипции рДНК и процессинге рРНК. Этот вывод подтверждается тем, что эти же белки связывались с GST-Surf6-dom мыши. Взаимодействие GST-Surf6-dom мыши также с ядерными и ядрышковыми белками, образующими другие функциональные группы, свидетельствует в пользу многофункциональности белка SURF6 человека.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выявление белковых партнеров SURF6 в ядерных экстрактах клеток HeLa методом аффинной адсорбции (GST pull-down) с использованием в качестве акцепторов GST-SURF6 человека и GST-Surf6-dom мыши. Первоначально мы предполагали идентифицировать белковые партнеры SURF6 человека методом аффинной адсорбции, используя для экспрессии в бактериях конструкцию pGEX-2T-
GST-SURF6, созданную нами ранее [27]. Эта плазмида содержит кДНК SURF6, слитую с геном глутатион^-трансферазы, под контролем инду-цибельного iac-промотора для экспрессии белка в клетках E. coli. Однако при анализе очищенного рекомбинантного GST-SURF6 методом электрофореза в ПААГ, мы столкнулись с тем, что кроме GST-SURF6 (электрофоретическая подвижность в районе 69 кДа) на геле регулярно выявлялись многочисленные дополнительные формы, занимающие нижнюю часть дорожки (рис. 2а). Появление этих форм нам устранить не удалось. Сходных проблем нам также не удалось избежать при экспрессии в E. coli консервативного С-концевого домена SURF6 человека, слитого с GST (не иллюстрировано). Мы полагаем, что трудности, возникшие с экспрессией 8иЯ¥6человека. в бактериях, вызваны наличием в мРНК SURF6 11 кодонов, редких для E. coli [27], которые способствовали преждевременной остановке трансляции, а также влиянием фолдинга рекомбинантного белка на его стабильность. При получении и очистке белка GST-Surf6-dom мыши более мелких белков не наблюдалось (рис. 2б; подробнее см. ниже).
Присутствие дополнительных продуктов неполной трансляции (протеолиза, агрегации) GST-SURF6, тем не менее, не препятствовало идентификации его белковых партнеров на им-муноблотах с использованием высокоспецифичных антител к ядрышковым белкам, основные функции которых на сегодняшний день установле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.