Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2013, том 39, № 6, с. 693-704
УДК 616-006.04:57.088
АНАЛИЗ ДЕВЯТИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ОНКОМАРКЕРОВ НА ГИДРОГЕЛЕВОМ БИОЧИПЕ
© 2013 г. Ж. И. Зубцова*, **, Е. Н. Савватеева*, В. И. Бутвиловская*, М. В. Цыбульская*, В. Р. Чечёткин*, Л. О. Самохина***, Л. И. Винницкий***, В. В. Масленников****, Ю. П. Резников****, А. С. Заседателев*, **, А. Ю. Рубина*, #
*ФГБУ Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 **ФГАОУВПО Московский физико-технический институт (Государственный университет), Москва ***ФГБУРоссийский Научный Центр Хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН, Москва ****ФГБУПоликлиника № 1 Управления делами Президента РФ, Москва Поступила в редакцию 10.04.2013 г. Принята к печати 17.06.2013 г.
Разработан прототип тест-системы для одновременного количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотке крови. Основной частью тест-системы является биочип ОМ-9, который содержит иммобилизованные антитела против девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионально-го антигена (РЭА), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), карбогидратных антигенов СА 15-3, СА 125, СА 19-9, свободной и общей форм простат-специфического антигена (ПСАсвоб, ПСАобщ), нейрон-специфической енолазы (НСЕ). Разработан протокол двустадийного сэндвич-анализа для проведения одновременного количественного определения девяти маркеров в сыворотке крови пациента. Получены основные аналитические характеристики метода, позволяющие рассматривать данный прототип тест-системы как перспективную разработку для дальнейшего клинического применения. Прототип тест-системы был апробирован на образцах сывороток крови больных онкологическими заболеваниями (252 сыворотки) и на сыворотках здоровых доноров (185 сывороток). Было показано, что для больных онкозаболеваниями превышение концентрации одного или нескольких онко-маркеров над уровнем нормы наблюдалось в 76.6% случаев, в то время как для здоровых доноров мы регистрировали такое превышение концентрации какого-либо маркера только в 6% случаев. Применение современных статистических методов обработки результатов медицинских исследований, ROC-анализа (receiver operating characteristic curves) и логистической регрессии, на примере группы больных колоректальным раком продемонстрировало значительно более высокую диагностическую эффективность одновременного анализа девяти онкомаркеров на биочипах (площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0.84) по сравнению с традиционным в таких случаях анализом двух маркеров РЭА и СА 19-9 (AUC = 0.59).
Разработанный прототип тест-системы может быть рекомендован как для оценки здоровья населения, например при проведении диспансеризации, так и для мониторирования опухолевого процесса в послеоперационном периоде или после курса специфической терапии.
Ключевые слова: белковые микрочипы, гидрогелевые биочипы, иммобилизованные антитела, колорек-тальный рак, одновременный иммуноанализ, онкомаркеры.
DOI: 10.7868/S0132342313060109
ВВЕДЕНИЕ
Среди множества онкомаркеров, предлагаемых для использования в клинической практике, лишь
Сокращения: АФП — альфа-фетопротеин, ИФА — иммуно-ферментный анализ, КВ — коэффициент вариации, НСЕ — нейрон-специфическая енолаза, ПСАобщ — общая форма простат-специфического антигена, ПСАсвоб — свободная форма простат-специфического антигена, РЭА — раково-эм-бриональный антиген, ФСБ — фосфатно-солевой буфер, ХГЧ — хорионический гонадотропин человека, СА 125, СА 15-3 и СА 19-9 — карбогидратные антигены 125, 1—3 и 19—9, Су5 — флуоресцентный краситель цианиновый пятый, ROC-анализ (ROC, receiver operating characteristic), AUC — площадь под ROC-кривой (area under ROC curve). # Автор для связи (тел.: +7 (499) 135-99-80; факс: +7 (499) 135-14-05; эл. почта: arubina@biochip.ru).
немногие выдержали испытание временем, и буквально единицы оказались пригодными для выявления ранних стадий канцерогенеза. Именно такие маркеры могут быть использованы для диагностики рака, поиска первичного очага опухоли, а также своевременного выявления рецидивирования процесса [1]. В настоящее время анализы, в которых определяют одновременно несколько онкомарке-ров, проводят крайне редко из-за дороговизны такого исследования и необходимости обеспечения исследователя довольно обширной номенклатурой диагностических тест-систем для иммунофермент-ного анализа (ИФА). Между тем, информация об одновременном содержании нескольких онкомар-
керов, наиболее часто вовлекаемых в онкологический процесс, может с большей точностью выделить группу риска по развитию заболевания [2, 3]. Идеальным инструментом для этого может оказаться мультиплексный анализ на основе биологических микрочипов (биочипов) — массивов ячеек, каждая из которых содержит индивидуальный молекулярный зонд, например, антитела против данного маркера или антиген (онкомаркер).
В лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН разработана технология изготовления гидрогелевых биочипов, по которой молекулярные зонды иммобилизуют в объеме полусферических гелевых ячеек в ходе фотоиндуцируемой со-полимеризации. Подобный метод иммобилизации предпочтителен при использовании молекулярных зондов белковой природы, так как препятствует денатурации белковых молекул и повышает чувствительность анализа [4, 5]. Одним из перспективных направлений исследований является разработка на основе гидрогелевых биочипов метода одновременного количественного определения различных биологических параметров в сыворотке крови человека, таких, например, как уровень маркеров онкологических заболеваний [6, 7].
В данной работе представлен прототип тест-системы, предназначенной для одновременного количественного определения девяти серологических онкомаркеров методом ИФА на биочипе. В качестве объектов были выбраны следующие серологические маркеры: альфа-фетопротеин (АФП), раково-эмбриональный антиген (РЭА), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), кар-богидратные антигены 15-3 (СА 15-3), 125 (СА 125), 19-9 (СА 19-9), общая форма простатспецифиче-ского антигена (ПСАобщ), а также его свободная фракция (ПСАсвоб) и нейронспецифиче-ская енолаза (НСЕ). Данные маркеры широко используются в клинической практике и ассоциированы с наиболее часто встречающимися видами раковых заболеваний (табл. 1).
Разработанный прототип тест-системы был охарактеризован (получены аналитические характеристики) и использован для одновременного определения девяти онкомаркеров в образцах сывороток крови больных онкологическими заболеваниями (252 сыворотки) и здоровых доноров (185 сывороток). Результаты исследований сопоставляли с таковыми, полученными традиционными методами ИФА на наборах фирм CanAg-Fujirebio (Швеция) и DSL (США). Было показано, что для больных онкозаболеваниями превышение концентрации одного или нескольких онкомаркеров над уровнем нормы наблюдалось в 76.6% случаев, в то время как для здоровых доноров мы регистрировали такое превышение
концентрации какого либо маркера только в 6% случаев.
Была проведена оценка диагностической эффективности тест-системы для выявления коло-ректального рака. В отдельную группу были выделены сыворотки крови пациентов с колоректаль-ным раком (33 сыворотки) и сыворотки пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (27 сывороток), также исследовали группу здоровых доноров. Показано, что при совместном определении концентраций девяти белковых онкомар-керов диагностическая эффективность анализа была выше(АиС = 0.84), чем при традиционном использовании только двух маркеров РЭА и СА 19-9 (АиС = 0.59).
Разработанный прототип тест-системы может быть рекомендован как для пред-, так и для послеоперационного мониторирования течения рака желудочно-кишечного тракта, а также для повышения надежности выявления рецидивов и ме-тастазирования опухоли.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Биочип ОМ-9
На первом этапе работы был создан биочип, содержащий иммобилизованные антитела против девяти онкомаркеров: АФП, РЭА, ХГЧ, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, НСЕ, ПСАобщ и ПСАсвоб, а также разработан протокол двустадийного сэндвич-анализа для проведения одновременного количественного определения данных маркеров в сыворотке крови пациента (рис. 1).
Для одновременного анализа девяти маркеров предварительно были получены калибровочные кривые, отражающие зависимость сигнала флуоресценции ячейки от концентрации онкомаркера в сыворотке крови (рис. 2). Каждая калибровочная кривая была получена в десяти повторах. Были определены основные аналитические характеристики метода: аналитическая чувствительность и специфичность. Было показано, что значения аналитической чувствительности на биочипах, изготовленных как на стеклянных, так и на металлизированных подложках [8], для каждого из онкомаркеров были ниже общепринятых значений нормы их содержания в крови (табл. 1).
Сравнение с референсным методом
Разработанный метод количественного анализа девяти онкомаркеров в сыворотке крови был апробирован на образцах сывороток крови больных онкологическими заболеваниями (252 сыворотки) и здоровых доноров (185 сывороток). Среди здоровых доноров, принявших участие в исследовании, было 35% женщин и 65% мужчин. Все доноры были моложе 60 лет. Среди пациентов с
Антитела против:
АФП
Антитела против:
НСЕ
ПСАобщ
ПСАсвоб
Рис. 1. Увеличенное в световом микроскопе изображение биочипа для проведения одновременного количественного им-муноанализа девяти онкомаркеров (АФП, РЭА, ХГЧ, СА 125, СА 15-3, СА 19-9, НСЕ, ПСАобщ и ПСАсвоб). Биочип содержит гелевые элементы, диаметром 120 мкм и объемом 0.1 нл (по четыре одинаковых элемента в ряду) с иммобилизованными моноклональными антителами против девяти онкомаркеров и контрольные ячейки, не содержащие биоматериала (пустые гели). По краям биочипа расположены необозначенные стрелками восемь маркерных гелевых ячеек, содержащих иммобилизованный BSA-Су5 (маркерные ячейки необходимы для набрасывания сетки в программе ImageAssay).
онкозаболеваниями было 52% женщин и 48% мужчин; 50% пациентов были моложе 60 лет, 39% — старше 60, возраст 11% пациентов неизвестен. Среди онкозаболеваний вс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.