МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 573-584
ОБЗОРЫ =
УДК 577.215.088 Ускоренная публикация
АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА ДНК-МИКРОЧИПАХ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ
© 2003 г. Ä. Е. Фролов1' 2, Э. К. Годвин2, О. О. Фаворова1*
1Кафедра молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 117437 2Department of Medical Oncology, Medical Science Division, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA 19111, USA
Поступила в редакцию 11.02.2003 г.
Злокачественная трансформация нормальных клеток происходит в результате накопления генетических и эпигенетических нарушений. Изучение молекулярной основы онкологических заболеваний с привлечением методов геномики и протеомики направлено на раскрытие всей сложности и многообразия процессов, приводящих к злокачественным перерождениям у человека. До недавнего времени диагноз и прогноз онкологического заболевания основывался на данных классической гистопатологии и косвенных эпидемиологических показателях, которые давали возможность лишь отнести ту или иную опухоль к широкому и довольно условному гистологическому или морфологическому подклассу. Развивающиеся в последние годы методы анализа дифференциальной экспрессии генов позволяют находить и изучать клинически значимые гены, меняющие уровень экспрессии при злокачественной трансформации клетки. Среди них метод гибридизации на ДНК-чипах, который предоставляет беспрецедентную возможность быстро оценить глобальную картину экспрессии десятков тысяч генов в определенный момент времени и сопоставить результаты детального комбинаторного анализа профилей экспрессии для дискретных состояний и этапов функционирования однотипных опухолевых и нормальных клеток. Получение индивидуальных "генетических портретов" опухолей различных типов способствует нахождению общих закономерностей и индивидуальных отличий в экспрессии отдельных генов, определению их функции и роли в патологическом процессе, а также развитию "молекулярной" нозологии рака. Обзор посвящен описанию основных технологических и методологических принципов использования ДНК-чипов и их применению в молекулярной классификации опухолей, при изучении лекарственной чувствительности и резистентности и для поиска биологических маркеров злокачественных новообразований.
Ключевые слова: дифференциальная экспрессия генов, дифференциальный дисплей, вычитатель-ная гибридизация, серийный анализ экспрессии генов, ДНК-микрочипы, транскриптом, онкобиоло-гия, лекарственная резистентность, биологические маркеры опухолей.
С завершением определения полной нуклео-тидной последовательности генома человека и нескольких других эукариот молекулярная биология вступает в постгеномную эру. Основное направление исследований сместилось от простого секвенирования ДНК к изучению функции полных генных последовательностей, цель которого -постижение общих принципов работы генома. Хотя точное число генов человека остается неиз-
Принятые сокращения: ОТ - обратная транскрипция; DD -Differential Display, дифференциальный дисплей; SH - Sub-tractive Hybridization, вычитательная гибридизация; SSH -Suppression Subtractive Hybridization, супрессивная вычитательная гибридизация; SAGE - Serial Analysis of Gene Expression, серийный анализ экспрессии генов, CGH - Comparative Genome Hybridization, сравнительная геномная гибридизация; SNP - Single Nucleotide Polymorphism, однонуклеотид-ный полиморфизм, EST - Expressed Sequence Tag, конец экс-прессирующейся последовательности.
* Эл. почта: mol-biol@cardio.ru
вестным, сегодня ученые склонны полагать, что оно близко к 40000. Судьба каждой клетки организма, обладающей одинаковым изначальным набором генов, определяется регуляцией экспрессии ограниченного числа необходимых генов, которое колеблется в зависимости от типа клетки, стадии ее развития и физиологических условий. Первый, транскрипционный уровень этой регуляции опосредован изменением относительного содержания специфических мРНК в клетке, тогда как посттранскрипционный контроль осуществляется на уровне процессинга (сплайсинга) мРНК и их трансляции.
Дифференциальная экспрессия генов лежит в основе процессов деления, роста и органогенеза высших эукариот. Поиск и изучение генов, меняющих уровень экспрессии, необходимы для понимания молекулярных механизмов регуляции этих процессов в норме и при патологических состоя-
ниях. Определение относительного содержания отдельных мРНК-транскриптов (или, по современной терминологии, компонентов транскрипто-ма) в различных тканях, на разных стадиях развития и при различных физико-химических воздействиях - необходимый этап этих исследований. Хотя мРНК не является конечным продуктом экспрессии гена, информация о динамическом изменении транскриптома необходима для понимания генетических регуляторных каскадов. Более того, на современном этапе развития молекулярной биологии анализ уровня мРНК более экономичен и эффективен, чем прямое определение количества белкового продукта гена в клетке. Несмотря на то, что зависимость между количеством мРНК и соответствующего белка не описывается линейной функцией, отсутствие в клетке мРНК-транскрипта данного гена с большой долей вероятности свидетельствует и об отсутствии ощутимых количеств его белкового продукта. Следовательно, на основании информации о составе транскриптома с высокой степенью достоверности могут быть сделаны качественные оценки совокупного состава клеточных белков (протеома). В настоящее время ведутся обширные исследования, направленные на изучение характера зависимости уровня белка от уровня мРНК [1] и возможности применения геномных технологий в протеомике [2, 3].
С середины прошлого десятилетия активно разрабатываются и успешно применяются биологические методы оценки экспрессии генов в системах in vitro и in vivo. В этом обзоре мы опишем методы анализа дифференциальной экспрессии генов, особое внимание уделяя методу ДНК-микрочипов (DNA microarrays) как наиболее технологичному и эффективному. В обзоре представлены также результаты изучения дифференциальной экспрессии генов в процессе онкогенеза с использованием технологии ДНК-микрочипов, свидетельствующие о значении этого метода для молекулярной классификации опухолей, идентификации их биологических маркеров и определения лекарственной чувствительности и резистентности в ходе химиотерапии онкологических заболеваний.
ЭВОЛЮЦИЯ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Помимо высокопроизводительной технологии ДНК-микрочипов, существуют альтернативные методы анализа дифференциальной экспрессии генов. К их числу принадлежат дифференциальный дисплей мРНК (Differential Display, DD) [4], вычитание кДНК-клонотек (вычитательная гибридизация, Subtractive Hybridization, SH) [5], супрессивная вычитательная гибридизация (Suppres-
sion Subtractive Hybridization, SSH) [6] и серийный анализ экспрессии генов (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) [7]. Хотя эти методы продолжают использоваться в настоящее время, им свойственна низкая воспроизводимость и малая эффективность анализа сложного набора мРНК, присутствующего в реальных транскриптомах. Как видно из названия, метод SSH является развитием метода SH. Метод SAGE по ряду параметров служит предшественником технологии ДНК-чипов, однако чрезвычайно сложен методически и имеет ряд ограничений. Мы остановимся на принципах и основных характеристиках каждого из этих методов. Более подробное их описание можно найти в обзорах [8-12].
Метод дифференциального дисплея мРНК (DD)
Метод DD изобретен 10 лет назад для изучения экспрессии генов эукариот. Несмотря на появление других методов, в PubMed ежегодно насчитываются сотни статей, в которых DD служит основной экспериментальной методикой. Главное достоинство DD - это его простота. Сочетание трех часто используемых методов молекулярной биологии - обратной транскрипции (ОТ) полиадени-лированной РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР) полученной кДНК и электрофореза продуктов в полиакриламидном геле (ПААГ) - позволяет визуализировать и сравнивать профили экспрессии двух популяций клеток, например, нормальных и злокачественных. На первом этапе проводится ОТ РНК высокого качества с использованием "якорных" праймеров, сконструированных к полиА-концу мРНК. На этапе пЦР-ампли-фикации используется тот же якорный праймер и второй "случайный" праймер. За счет малой длины этих DD-праймеров (10-13 н.) они могут связываться с максимальным числом последовательностей матрицы, что дает возможность при разделении конечного продукта DD в ПААГ визуализировать специфический профиль экспрессии, включающий различные виды молекул кДНК. Сравнение профилей нескольких образцов позволяет выявить различия в уровнях экспрессии некоторых генов. Эти гены могут быть в дальнейшем выделены и проанализированы. Такой подход применим для одновременного анализа экспрессии генов в неограниченном количестве образцов, полученных в различных физиологических состояниях (например, при разных терапевтических воздействиях), а также для сравнения экспрессии генов у носителей различных фенотипов и генотипов. Со времени создания метод DD претерпел различные модификации, которые рассмотрены в обзорах [13, 14].
Выявленные с помощью DD полосы ДНК в большинстве случаев соответствуют широко-представленным мРНК [15]. Дальнейший анализ
включает секвенирование фрагментов кДНК, их аннотирование и подтверждение факта дифференциальной экспрессии каждого гена. Один из недостатков DD - субъективность при выборе полос ДНК, зависящая как от опыта исследователя, так и от его предпочтений (преимущественный поиск генов, экспрессия которых возросла или уменьшилась, вновь возникла или исчезла и т.п.). Существуют методики DD, включающие выделение полос кДНК и их повторную ПЦР-амплифи-кацию с применением как флуоресцентной [16], так и радиоизотопной метки [4]. Второй и основной недостаток этого метода - большое количество ложноположительных сигналов [17], вследствие чего результаты необходимо перепроверять. С этой цел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.