ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 3, с. 315-322
УДК 547.963.32:575.852.113:599.36
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА
АНАЛИЗ ДНК ВЫСШИХ ПРИМАТОВ С ПОМОЩЬЮ INTER-SINE-ПЦР
© 2008 г. Н. Л. Рябинина1, А. А. Банникова2, В. А. Шереметьева2,
М. Г. Чикобава3, Б. А. Лапин3, Д. А. Крамеров1
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: kramerov@eimb.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра зоологии позвоночных, Москва 119992 3 Научно-исследователъский институт медицинской приматологии, Сочи-Адлер 354376
Поступила в редакцию 20.04.2007 г.
Два вида (MIR и Alu) коротких рассеянных по геному повторяющихся последовательностей ДНК (SINE) использовали для изучения генетического родства между высшими приматами и выявления полиморфизма геномной ДНК человека. В полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными консенсусным последовательностям повторов MIR и Alu, амплифицировали участки ДНК, расположенные между соседними копиями этих SINEs (интер^МЕ-ПЦР). Сравнение набора амплифи-цированных фрагментов ДНК для разных видов или особей позволяет судить об их родстве. Интер-MIR-ПЦР подтвердил известные из литературы родственные связи между видами высших приматов инфраотряда Catarrhini, что доказывает применимость этого метода для изучения филогении. Полиморфизм ДНК человека не удавалось обнаружить, используя интер-МШ.-ПЦР. Такой полиморфизм был выявлен с помощью интер-А1и-ПЦР, что, возможно, связано с продолжающимся размножением Alu в геноме человека.
По геномам млекопитающих и многих других эукариот разбросано огромное число (105-106) копий повторяющихся последовательностей ДНК, именуемых короткими ретропозонами, или SINE (short interspersed elements) [1]. Они размножились в ходе эволюции благодаря процессу ретропози-ции, который включает в себя транскрипцию этих элементов РНК-полимеразой ill и обратную транскрипцию, сопряженную с интеграцией синтезирующейся ДНК в новый участок генома. Благодаря мутациям, накапливавшимся в течение миллионов лет, копии каждого SINE, в совокупности образующие семейство данного SINE, отличаются друг от друга обычно 10-30% оснований. В геноме имеется не более 3-4 семейств SINE, причем каждое из них характерно только для одного или нескольких семейств (иногда отрядов) организмов.
В геномах высших приматов имеется только два семейства SINEs - Alu и MIR [2]. Первый относится к уникальному типу SINEs, который вместе с В1-семейством SINE грызунов ведет свое происхождение от 7SL РНК - компонента цито-плазматических частиц (SRP), участвующих в секреции полипептидов из клеток. Alu, имеющий длину около 300 пн, в отличие от В1, состоит из двух сходных по структуре частей (мономеров), обладающих гомологией с 7SL РНК [3, 4].
MIR, как и подавляющее большинство SINE других известных семейств, ведет свое происхождение от молекул тРНК, о чем свидетельствует
структура нуклеотидной последовательности, расположенной в 5'-концевой ("головной") части этих коротких ретропозонов [5, 6]. Одна из особенностей MIR - это широкое распространение. Данное семейство SINE имеется в геномах всех млекопитающих, а возможно, и других позвоночных [7]. Отсюда следует, что MIR возник как минимум 130 млн лет назад, что подтверждается чрезвычайно высокой дивергированностью копий SINEs данного семейства (средняя гомология между копиями составляет только 70%). По неясной пока причине наиболее консервативной частью MIR-элемента является его центральная часть (core), лежащая между тРНК-родственной и "хвостовой" частями [6, 8]. Поэтому в большинстве копий, в отличие от полноразмерного MIR длиной около 260 пн, обнаруживается только эта "core" последовательность длиною в среднем 65 пн [7].
В последние годы для изучения филогенетических связей между видами мы развивали метод интер-SINE-ПЦР [9]. Первоначально этот метод был применен для детекции и доказательства широкого распространения элемента MIR у млекопитающих [7]. В результате такой полимеразной цепной реакции происходит амплификация участков геномной ДНК длиной менее 3 тпн, которые ограничены с двух сторон копиями SINEs. После разделения амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза в полиакрила-мидном геле можно оценить степень родства таксонов видового и подвидового уровня на основе
сходства получаемых наборов полос. Метод ин-тер-МШ-ПЦР оказался достаточно успешным в оценке филогенетического родства видов и родов рукокрылых [10], насекомоядных [9, 11, 12] и некоторых грызунов [13].
Филогения приматов наиболее исследована с применением различных молекулярных методов, основанных на анализе митохондриальных и ядерных генов [14-17]. В настоящей работе мы использовали интер-МШ-ПЦР для анализа филогенетических отношений высших обезьян (Са1аг-гЫш) для того, чтобы проверить, в какой мере результаты этого простого и дешевого метода совпадают с результатами других методов. Кроме того, в этой работе мы предложили новый подход к дизайну праймеров, который позволил анализировать суммарную геномную ДНК приматов с помощью интер-Л1и-ПЦР. Такая ПЦР дала возможность детектировать полиморфизм ДНК человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение ДНК и UHmep-SINE-ПЦР. Геномную ДНК выделяли из крови [18] или из фиксированных этанолом тканей (мышцы, плацента) путем лизиса гомогената протеиназой K с последующей депротеинизацией смесью фенола и хлороформа (1 : 1). Список препаратов ДНК, использованных в работе, представлен в таблице.
Интер-МШ-ПЦР проводили с использованием двух затравок, комплементарных последовательности MIR [7]: 5'-AGTGACTTGCTCAAGGT-3' (MIR17) и 5'-GCCTCAGTTTCCTCATC-3' (MIL17). Обе затравки метили (у32Р)-АТР (1 МБк/100 пмоль олигонуклеотида) с помощью полинуклеотидки-назы. Реакционная смесь (20 мкл) содержала буфер (70 мМ трис-HCl, pH 8.6, 16.6 мМ (NH4)2SO4, 2.5 мМ MgCl2), 0.2 мМ dNTP, 4 пмоль каждой меченой затравки, 1 ед. Гад-полимеразы ("Силекс", Россия) и 25 нг геномной ДНК. Условия интер-MIR-ПЦР соответствовали описанным [7]: дена-
Гeогpaфия и число обpaзцов, иcпользовaнныx в aнaлизe
Гeогpaфия обpaзцов
Число обpaзцов
Иcточниí полyчeния обpaзцов
Homo sapiens 13 1 1 1 1
Pyrerae, eвpопeйcíaя чacть Pоccии Aфгaнцы, Aфгaниcтaн
Tyвинцы, TyBa, Tотжeнcíий p-н, с. Tооpa-Xeм
Эвeнíи, Яíyтия, пгт Золотинía
Kоpяíи, KоpяíCíий нaционaльный оípyг, п-ов Kaмчaтía
Индeйцы, Ceвepнaя Aмepиía 4
Bьeтнaмцы, Bьeтнaм 1
Мaлaгacийцы (aнтaдpyи), о. Мaдaгacíap 1
Hьямвeзи, Taнзaния 1
Бaмбapa, Мaли 1
Ty6y, Чaд 1
Hapоды Hигepии, Hигepия 1 Этничecíaя пpинaдлeжноcть те извecтнa, Pоccия
Oбeзьяны инфpоотpядa
ИМБ PAH
МГУ, íaф. aнтpопологии ^ жe
ИМБ PAH
МГУ, íaф. aнтpопологии Tо жe
ИМБ PAH Catarrhini
Pan troglodytes - шимпанзе обыкновенная 1 Можовсшй зоопapí
Gorilla gorilla - горилла 1 Heмeцíий ^rnp пpимaтологии
Pongo pygmaeus - орангутан обыкновенный 1 Можовсшй зоопapí
Hylobates lar - гиббон белорукий 1 Heмeцíий ^rnp пpимaтологии
Macaca silenus - макак львинохвостый 1 Можовсшй зоопapí
Macaca arctoides - макак бурый 1 ГУ HИИ мeдицинcíой пpимaтологии PAMH
Macaca mulatta - макак резус 1 Моcíовcíий зоопapí
Papio anubis - павиан анубис 1 ГУ HИИ мeдицинcíой пpимaтологии PAMH
Papio hamadryas - павиан гамадрил 1 Tо жe
Chlorocebus aethiops - мартышка зеленая 1 »
»
»
»
l 2 З 4 5 б l S 9 lO ll l2 1З l4 l5 l6 ll lS l9 20 2l 22 2З 24 25 26 21 2S 29 З0 З1 З2 ЗЗ З4
15G
Рис. 1. Интер-МЖ-ПЦР геномной ДНК людей и обезьян. Homo sapiens (1-24). Обезьяны: шимпанзе обыкновенная Pan troglodytes (25), горилла Gorilla gorilla (26), орангутан обыкновенный Pongo pygmaeus (27), гиббон белорукий Hylobates lar (28), макак львинохвостый Macaca silenus (29), макак бурый M. arctoides (30), макак резус M. mulatta (31), павиан анубис Papio anubis (32), павиан гамадрил P. hamadryas (33) и мартышка зеленая Chlorocebus aethiops (34). Разделение денатурированных ДНК-фрагментов проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с мочевиной. Справа от электрофореграммы указаны размеры маркерных фрагментов (ДНК ФХ147, гидролизованная Hinfl).
турация - 94°С, 30 с; отжиг - 56°С, 45 с; синтез -72°С, 2 мин. Число циклов - 27. Предварительная денатурация продолжалась 3 мин при 94°С, конечный синтез - 5 мин при 72°С.
При проведении интер-А1и-ПЦР использовали единственную затравку: 5'-CCACCGCGCCCGGC-
CAG-3' (подчepкнyты нyклeотиды, комплeмeн-тapныe 5'-КОНЦУ КОН^НСУСНОЙ поcлeдовaтeльно-сти Alu-элeмeнтa; ПЦP должта пpоиcxодить только с yчacтиeм тex копий Alu, 5'-флaнкиpyю-щaя поcлeдовaтeльноcть ^TOphix нaчинaeтcя с динyклeотидa 5'-CT-3'). Oлигонyклeотид мeтили,
reHETMKA том 44 < 3 2QQS
NJ MP
Hylobates lar
Pongo pygmaeus
58
- Gorilla gorilla
74
75
- Homo sapiens
- Pan troglodytes
1GG
99
Chlorocebus aethiops
87
86
76
SG
Macaca arctoides
75
79
Macaca silenus
Macaca mulatta
Papio anubis
73
70
Papio hamadryas
Рис. 2. Неукорененная дендрограмма филогенетических отношений исследованных приматов по результатам интер-МЖ-ПЦР, построенная методом ближайшего связывания (N1) на основе генетических дистанций Нея и Ли. Для кластеров, достоверность которых выше 50%, указаны индексы бутстрэпа (% от 1000 реплик): над ветвями - в анализе ближайшего связывания (N1), под ветвями - в парсимониаль-ном анализе (МР).
как описано выше. ПЦР осуществляли так же, как в случае интер-МШ-ПЦр, но отжиг затравки и синтез шли при одной и той же температуре (72°С) и продолжительность этой стадии составляла 3 мин.
Меченые продукты ПЦР денатурировали и разделяли электрофорезом в 6%-ном полиакрил-амидном геле, содержащем трис-боратный буфер и 8 М мочевину (длина геля 50 см, ширина - 28 см, толщина 0.4 мм). Разделение вели в течение 7 ч при постоянной мощности тока 75 Вт. Гель инкубировали 30 мин в растворе 5%-ной уксусной кислоты и 10%-ного этанола, после чего сушили и экспонировали с рентгеновской пленкой (18-24 ч).
Интер-Л1и-ПЦР с немеченой затравкой проводили по аналогии с описанной выше процедурой, но количество олигонуклеотида в реакционной
смеси составляло 7.5 пмоль. Продукты амплификации разделяли в течение ночи электрофорезом в 2%-ном агар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.