РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), №. 1 с.
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ И МЕХАНИЗМОВ КООПЕРАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
И ИГЛОКОЖИХ
© 2007 г. И.С. Дьячков, И.В. Кудрявцев
Отдел иммунологии.
ГУ НИИ экспериментальной медицины. РАМН
Работа посвящена анализу клеточных реакций врожденного иммунитета морской звезды Asterias rubens. Число циркулирующих целомоцитов, уровень продукции ими активных форм кислорода, динамику выведения гемоглобина человека и бактерий из целомической жидкости оценивали до иммунизации, а также на сроках 1 — 120 ч. Также сравнивали метаболическую и пролиферативную активности целомоцитов в ответ на митогенную стимуляцию in vitro с использованием радиометрического учета включения меченых тимиди-на и уридина, а также по результатам МТТ-теста. Установлено, что время элиминации растворимых и корпускулярных антигенов составляет 12 — 24 ч. В ответ на иммунизацию происходит увеличение числа циркулирующих клеток и усиление продукции активных форм кислорода. Впервые в экспериментах in vitro показана митоген-индуцированная пролиферация циркулирующих целомоцитов морских звезд. Усиление пролиферативной активности in vitro по срокам на 24 ч предшествовало повышению синтеза O- циркулирующими клетками в опытах in vivo. Обсуждается роль и место защитных реакций иглокожих в процессе становления реакций врожденного и приобретенного иммунитета позвоночных. Ставится вопрос о механизмах кооперации эффекторных клеток в защитных реакциях иглокожих и о причинах возникновения реакций приобретенного иммунитета. Ключевые слова: сравнительная иммунология, врожденный иммунитет, иглокожие, клеточные реакции, регуляция
ВВЕДЕНИЕ
Проблема становления механизмов приобретенного иммунитета неразрывным образом связана с ранними этапами эволюции вторичноротых животных. Эволюционные корни реакций приобретенного иммунитета, а, следовательно, и причины их возникновения и исходные функции остаются неясными до настоящего времени. Появление приобретенного иммунитета уникально с той точки зрения, что параллельно шел процесс развития гораздо более древней и не менее эффективной системы врожденного иммунитета. Поэтому ВсЫиойеттаЬа представляют важнейшую группу организмов, в пределах которой можно наблюдать как наличие сложных механизмов врожденного иммунитета, так и
Адрес: 197376 Санкт-Петербург, ул. академика
Павлова, 12
Тел. (812) 234-16-69
vano306@yandex.ru
igorek1981@yandex.ru
первые признаки зарождения реакций приобретенного иммунитета, план организации и иерархия которых будут едины для всех вто-ричноротых и максимально разовьются у позвоночных животных.
Ранее был установлен ряд характеристик защитной системы иглокожих. В опытах с ауто-и аллотрансплантатами участков покровов морских ежей была показана способность их клеток различать свое и не-свое [1]. Вместе с тем, постулировалось отсутствие у данной группы иммунологической памяти [2] и способности к специфическому распознаванию антигенов [3], последнее в настоящее время подвергается сомнению. Обладая всеми основными защитными механизмами, свойственными большинству беспозвоночных животных, иглокожие проявляют некоторые защитные реакции, характерные для системы врожденного иммунитета высших позвоночных животных. Так, целомоциты (циркулирующие клетки) морских звезд в ответ на стимуляцию способны продуцировать активные формы кислорода и оксид азота N0 [4]. В ответ
на стимуляцию бактериальным ЛПС в этих клетках удалось показать экспрессию ряда ре-гуляторных молекул, гомологичных таким транскрипционным факторам лимфоцитов млекопитающих как NF-kB, GATA и Runt [5]. В активированных бактериальными ЛПС цело-моцитах морского ежа Strongylocentrotus pur-puratus также начинается экспрессия генов, кодирующих ингибиторы бактериальных про-теаз, сериновые протеазы, сходные с тромбином, эластазой, плазмином [6] (Smith et al., 1996). Выявлена комплемент-подобная активность целомической жидкости ряда представителей иглокожих, а у морских ежей были выделены гомологи факторов В и С3 каскада комплемента млекопитающих [7]. Есть основания предполагать, что на целомоцитах морских ежей имеются рецепторы для продуктов ограниченного протеолиза С3 — одного из самых эволюционно ранних и важнейших компонентов комплемента [8, 9]. Некоторые клетки аксиального органа морской звезды Asterias rubens способны к синтезу цитокино-подобных молекул и экспрессии рецепторов, схожих с рецепторами для IL-1, -2, -6, а также для IFN-y [10]. В аксиальном органе этой морской звезды также допускают существование двух популяций лимфоцитоподобных клеток, способных отвечать пролиферацией на Т- и В-митогены [11].
Среди веществ целомической жидкости (ЦЖ), участвующих в элиминации антигенов, выделяют гемолизины, агглютинины и антимикробные факторы [12]. Нафтахиновый пигмент эхинохром проявляет сильные бактерицидные и бактериостатические эффекты и антиоксидантные свойства [13]. В ЦЖ иглокожих были обнаружены лизоцим и термоустойчивый низкомолекулярный фактор, обладающий антибактериальными свойствами [14]. Этот и другие факторы целомической жидкости подавляют активность Грам-отри-цательных, но не Грам-положительных бактерий, которые в свою очередь уничтожаются преимущественно фагоцитами [2, 15].
Защитные реакции иглокожих несомненно относятся к механизмам врожденного иммунитета, на универсальный характер которых и распространенность во всех таксонах животных указывал еще И.И. Мечников [16]. У иглокожих, находящихся у основания ствола вто-ричноротых животных, роль клеточных реакций в защите внутренней среды преобладает над ролью гуморальных реакций, что, по всей видимости, отражает последовательность событий при становлении механизмов врожден-
ного иммунитета. Вместе с тем, анализ механизмов регуляции и оценка эффективности клеточных реакций врожденного иммунитета иглокожих пока не нашли исчерпывающего описания в литературе, что обусловливает актуальность изучения процессов элиминации антигенов, эффективность которых обеспечивается кооперацией клеточных факторов уже на этой ранней стадии эволюции иммунной системы. Поэтому целью данной работы было исследование скорости элиминации антигенов и параметров клеточных защитных реакций иглокожих in vivo и in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте было использовано около 600 беломорских морских звезд Asterias rubens (ECHINODERMATA). Животным контрольной группы путем инъекции в конец одного из лучей вводили 1 мл 0,14М р-ра NaCl (физиологический раствор, ФР). Животные опытной группы получали 1 мл 2% суспензии эритроцитов человека (ЭЧ), либо равный объем культуры живых бактерий рода Pseudomonas, выделенных с покровов A.rubens и наращенных in vitro. Забор ЦЖ с клетками осуществляли с помощью одноразового стерильного шприца через 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения антигена или нанесения повреждения покровов, а также до начала эксперимента (точка 0 ч). Коагуляцию 0,95 мл ЦЖ блокировали внесением 0,05 мл 0,3М раствора ЭДТА. Во всех образцах определяли концентрацию и общее число полученных целомоцитов (при помощи гемоци-тометра Горяева), которых осаждали центрифугированием при 100g в течение 5 — 7 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в изото-ничной фильтрованной через мембрану морской воде (ФМВ). Уровень стимулированного НСТ-теста оценивали, добавляя к 100 мкл клеточной суспензии 50 мкл 0,4% суспензии зи-мозана, а спонтанного — внося равный объем ФМВ. Срок инкубации с 50 мкл 0,4% р-ра НСТ составлял 12 ч при 6—10 °С, что соответствовало физиологическим условиям. Фиксацию и растворение гранул диформазана НСТ проводили по традиционной схеме с использованием смеси ДМСО и 2М КОН. После спект-рофотометрии при у = 620 нм результат
продукции O- выражали в единицах ОП на 1 млн целомоцитов.
Для определения времени элиминации гемоглобина использовали пероксидазную активность геминовой группы. С этой це-
лью к 50 мкл ЦЖ добавляли 50 мкл хромо-генной смеси (0,5% раствор ОФД на фос-фат-цитратном буфере с рН5,0 и 0,01% Н2О2). Образцы в двух параллелях инкубировали 75 мин в темноте при 37 °С, после чего реакцию останавливали внесением 50 мкл 2М серной кислоты, интенсивность реакции определяли при X = 492 нм, результаты выражали в единицах ОП. При оценке времени элиминации бактерий использовали метод мерных высевов. Образцы ЦЖ наносили на чашку Петри в объеме 0,2 мл и равномерно распределяли по поверхности среды следующего состава: глюкоза — 0,1%, гидролизат казеина — 0,1%, пептон — 0,1%, №С1 — 2,4%, агар — 2%. Просмотр и подсчет выросших колоний производили визуально через 10 дней после высева.
Метаболическую активность целомоцитов определяли в МТТ-тесте. К 100 мкл суспензии, содержавшей 2 х 105 целомоцитов, добавляли по 10 мкл 0,25% р-ра МТТ. После 12 ч инкубации при физиологических условиях надосадок со свободным красителем удаляли, а гранулы МТТ в клетках растворяли лизиру-ющим буфером, содержащим подкисленный раствор SDS на трис-буфере. Результат спектрометрии при X = 570 нм выражали в единицах ОП на 1 млн клеток.
Оценку митогенного влияния ФГА, Кон А и лимфоцитарного митогена (ЛМ) на цело-моциты морской звезды вели в адаптированной модификации реакции бласттрансфор-мации. В состав культуральной среды входили среда ИРМ1-1640 с подведённой осмотич-ностью до 25%о, стабилизированная добавлением HEPES и бикарбоната Na и обогащенная 2% эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Все компоненты среды стерилизовали мембранной фильтрацией. Целомоциты А.гиЬепв инкубировали в лунках камеры Терасаки в объёме 15 мкл методом "висячей капли" при 1 = 15 °С во влажной атмосфере. Клетки стимулировали внесением 5 мкл разных концентраций ФГА, Кон А и ЛМ в течение 12, 24, 48, 72, 96 ч. Контролем служило внесение равного объема культуральной среды. Об уровне метаболической и пролиферативной активностей судили по включению меченых по тритию уридина и тимидина, которых вносили на последние 12 ч инкубации в объеме 2 мкл. Учет включившейся метки вели на сцинтил-ляционном счётчике ИаскЬе1а, и результат выражали числом импульсо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.