INVESTIGATION OF THE SURFACE PHENOTYPE OF LYMPHOCYTES IN CHILDREN WITH MYOPIA
Khamnagdaeva N. V.1, Semenova L. Y.1, Salmasi J. M.1, Poryadin G. V.1, Kazimirskiy A. N.1, Obrubov S. A.2, Rogozhina I. V.3, Balhanova L.TS.1
'Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, RNIMU; 2Ophthalmology Department of Pediatric faculty, RNIMU; 3FGBI «Children's out-patient clinic» UDP RF, Moscow, Russia
Objective. To investigate immunological profile in patients with myopia. In 6 patients with confirmed diagnosis of myopia lymphocytes with expressed antigens CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD20, CD72, CD38, CD23, CD25, CD71, HLA-DR, CD95, CD22, CD54, mIgM, mIgG were counted. With myopia in children, there is a decrease in the number of lymphocytes with the phenotype of CD4. Also, there is an increase of expression of early and late markers of lymphocyte activation CD25 and HLA-DR. Observed a significant decrease in expression of intercellular adhesion molecule ICAM-1 and the number of plasma cells, completing the process of differentiation CD38.
Key words: myopia, children, lymphocytes
АНАЛИЗ ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИИ И ЭКСПРЕССИИ МРНК TLR2 И TLR4 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНЫМИ ИММУНОДЕФИЦИТАМИ
Хорева М. В., Никонова А. С., Пащенко О. Е., Кондратенко И. В., Грачева Л. А.1, Бологов А. А.
ГБОУ ВПО РНИМУ им Н. И. Пирогова Минздрава России; ФГБУ РДКБ Минздрава России,
Москва, Россия
В настоящей работе проанализированы экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 и эффекторная функция TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) и здоровых доноров. В группе больных ОВИН и Х-АГГ выявили снижение индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 продукции ТОТа. У больных ОВИН наблюдается дисбаланс в продукции цитокинов (ТОТа и №Ыа) в ответ на лиганд TLR4 - ЛПС. По уровню экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в группе больных ОВИН выделены 2 подгруппы: больные с высокими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и с низкими значениями экспрессии по сравнению с контрольной группой (р<0,05). У детей с Х-АГГ статистически значимых изменений в экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови не обнаружено. Выявленные изменения у больных ОВИН и Х-АГГ помогают уточнить патогенез и в дальнейшем могут служить новой терапевтической мишенью в их лечении.
Ключевые слова: TLR2, TLR4, TNFа, ^а, ОВИН, Х-АГГ
Актуальной проблемой современной иммунологии в настоящее время является изучение механизмов врожденного иммунитета. То11-подобные рецепторы (TLR) - ключевые рецепторы врожденного иммунитета, они распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так назы-
ваемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns - PAMP). К наиболее известным ли-гандам TLRs экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, ви-
русная РНК и многие другие. Взаимодействие TLR с их лигандами инициирует активацию сигнальных путей, в результате происходит экспрессия генов провоспалительных цитоки-нов (фактора некроза опухоли - TNFa, интер-лейкина-1 - IL-1, IL-6, IL-12, интерферонов I типа - IFN a/p), хемокинов, костимуляторных молекул. Продукты этих генов регулируют реакции врожденного иммунитета и направляют развитие адаптивного иммунного ответа [1, 2, 3]. Накапливаются сведения о патологиях, вызванных нарушениями в системе TLR [4].
Первичные иммунодефициты (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность (ОВИН) и Х-сцепленная агаммаглобули-немия (Х-АГГ) характеризуются частыми рекуррентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания анти-генпрезентирующих клеток у больных ОВИН [5, 6]. Исследование компонентов системы TLR у больных ПИД с дефектами антителообразования позволит оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений в этой группе больных.
Цель исследования: определить эффектор-ную функциональную активность TLR2 и TLR4, и уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в мо-нонуклеарных клетках периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ.
Материал и методы. Характеристика обследуемых групп пациентов: Больные ПИД: I группа - больные ОВИН в возрасте 6-17 лет (n= 14), II группа - больные X-АГГ в возрасте 4-17 лет (n= 9). Контрольную группу составили здоровые доноры в возрасте 20-40 лет (n= 15) и здоровые дети в возрасте 10-15 лет (n= 9).
Выделение и культивирование мононукле-арных клеток (МНК) периферической крови. МНК периферической крови здоровых людей и больных ПИД выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина. МНК в концентрации 106 /мл культивировали 24 часа в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2mM L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина при 37°С с 5% СО2. Для индукции выработки ци-токинов использовали лиганды TLR2 - пеп-тидогликан (ПГ) (Staphylococcus aureus, «Sigma/
Fluka») в концентрации 2,5 мкг/мл и TLR4 - ли-пополисахарид (ЛПС) (E.coli 0127: B8, «Sigma») в концентрации 0,1 мкг/мл. Полученные су-пернатанты хранили в течение 2-3 месяцев при -70°С.
Определение цитокинов. Содержание ци-токинов (TNFa, IFNa) в супернатантах МНК определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов («e-Biosciences»).
Определение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4. Выделение РНК из МНК периферической крови человека проводили с использованием коммерческих наборов «RNeasy Plus Mini Kit» («Qiagen», Германия). Каждый образец содержал 1х106 клеток. Реакцию обратной транскрипции проводили, используя набор реагентов «High capacity RNA to cDNA Master mix» («Applied Biosystems», США). Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Уровни экспрессии TLR нормировали по гену ß-актина. Использовали следующие праймеры: tlr2-Hs01014511_m1; tlr4-Hs00152939_m1; beta-actin Human ACTB Endogenous Control (FAM / MGB Probe). Анализ проводили на приборе 7500, Applied Biosystems. Для анализа данных использовали метод AACt. Экспрессию мРНК TLR2 и TLR4 в МНК оценивали в относительных единицах (ОЕ) и рассчитывали как RQ=2-AACt.
Статистическую обработку результатов исследований производили в программном пакете Stat Soft Statistica 6.0 с использованием непараметрических критериев. Различия показателей в группах считали статистически значимым при P<0,05.
Результаты. На первом этапе оценивали эф-фекторную функциональную активность TLR2 и TLR4 на МНК у больных ПИД с дефектами антителообразования, используя модель активации МНК периферической крови TLR агони-стами. Эффекторную функцию TLR определяли по отношению индуцированной лигандами TLR выработке TNFa или IFNa МНК периферической крови к спонтанной выработке этих цитокинов (КС). В ходе исследования выявлено, что у больных ОВИН и Х-АГГ повышена спонтанная выработка TNFa, что свидетельствует о повышенной функциональной активности клеток-продуцентов цитокина. Однако при оценке эффекторной функции TLR2 и TLR4 у больных ОВИН и Х-АГГ выявили сниженные по сравнению со здоровыми доно-
рами значения КС в ответ на ЛПС и ПГ (табл.), т.е. у этих больных нарушена потенциальная способность МНК «отвечать» на лиганды TLR2 и TLR4. При этом низкие значения эффектор-ной функции рецепторов сопровождались повышенной частотой развития бактериальных инфекций и других осложнений у таких больных. В группе больных ОВИН мы выявили двух больных, у которых спонтанная выработка ТЫБа превышала 1000 пг/мл, при этом лиганды TLR не оказывали стимулирующего влияния на продукцию цитокина. Основное заболевание у этих больных осложнялось развитием злокачественных новообразований. Исследование влияния лиганда TLR4 на выработку 1БЫа МНК периферической крови в исследуемых группах показало, что в группе больных ОВИН КСЛПС выше по сравнению с показателями в контрольной группе (табл.). Таким образом, в группе больных ОВИН выявили нарушенные значения ЛПС-индуцированной выработки ТЫБа (сниженный КСЛПС) и ЛПС- индуцированной выработки 1БЫа (повышенный КСЛПС) МНК периферической крови, что свидетельствуют о дисбалансе в продукции цитокинов в ответ на лиганд TLR4 - ЛПС.
Следующий этап исследования включал оценку экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови. При анализе полученных результатов (табл.) выявили, что экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 в контрольной группе детей выше, чем в группе взрослых доноров,
р<0,05. По уровню экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в группе детей больных ОВИН выделены 2 подгруппы: больные с высокими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и с низкими значениями экспрессии по сравнению с контрольными группами детей и взрослыми донорами, различия между этими подгруппами статистически значимы (р<0,05). У детей с Х-АГГ статистически значимых изменений в экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови не выявлено.
Обсуждение результатов. Таким образом, у больных ПИД с дефектами антителообразова-ния мы наблюдали нарушение продукции ТЫБа под влиянием лигандов TLR2 и TLR4. Дефект стимулирующего влияния ЛПС, ПГ на выработку ТЫБа МНК периферической крови больных, возможно, объясняется нарушениями экспрессии соответствующих рецепторов, трансдук-ции сигнала от этих рецепторов, полиморфизмом генов. Нарушение TLR-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, особенно ТЫБа, может приводить к дефектам процессинга и презентации антигенов, созревания и функционирования антигенпрезенти-рующих клеток, описанному у больных ОВИН [5, 6], и, в дальнейшем, к нарушению развития адаптивного иммунного ответа. Обнаруженный дисбаланс индуцированной ЛПС выработки ТЫБа и 1БЫа у больных ОВИН, возможно, обусловлен вовлечением в активацию транскрипционного фактора TRIF, а не МуБ88, веду-
Таблица. Значения эффекторной функции и экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 в МНК периферической крови больных ПИД
Группы Показатели Бол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.