научная статья по теме АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК MIR-200C И MIR-145 В КОЛОРЕКТАЛЬНЫХ РАКАХ РАЗНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПОВ Математика

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ МИКРОРНК MIR-200C И MIR-145 В КОЛОРЕКТАЛЬНЫХ РАКАХ РАЗНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПОВ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 4, с. 491-495

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.218+616-006.66

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ микроРНК ш1Я-200е И ш1Я-145 В КОЛОРЕКТАЛЬНЫХ РАКАХ РАЗНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДТИПОВ

© 2015 г. Ю. А. Шелыгин, В. П. Шубин, С. А. Фролов, С. И. Ачкасов, О. И. Сушков, А. С. Цуканов, В. Н. Кашников, Н. И. Поспехова

Представлено академиком В.И. Чиссовым 01.12.2014 г. Поступило 16.03.2015 г.

Исследовали уровни экспрессии микроРНК ш1Я-200с и ш1Я-145 в двух группах колоректального рака, различных по наличию/отсутствию процесса эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). В ЭМП-позитивном раке повышен уровень ш1Я-145 и снижен ш1Я-200с, обратная картина наблюдается в ЭМП-негативном раке. М1Я-145 может служить маркёром мезенхимального подтипа рака. Профили экспрессии генов и микроРНК позволяют выделять прогностически неблагоприятные опухоли мезенхимального подтипа.

DOI: 10.7868/S0869565215220272

Высокая гетерогенность колоректального рака (КРР) обусловливает необходимость классификации и анализа различных его подтипов. Одним из современных подходов к такой классификации является определение молекулярно-генети-ческих характеристик опухоли, основанное на идентификации различных соматических изменений, детекции уровня экспрессии ряда генов (gene signature), а также профиля экспрессии микроРНК (miR). МикроРНК — малые некоди-рующие РНК, которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, вызывая деградацию мРНК-мишеней или нарушение трансляции [1]. Многие микроРНК вовлечены в процесс канцерогенеза и могут функционировать как онкогены или супрессоры опухоли. Изучение микроРНК в разных типах рака дает возможность использовать их в качестве потенциальных биомаркёров и прогностических факторов для персонификации терапии онкологических больных.

В настоящей работе проведена оценка показателей экспрессии микроРНК miR-200с и miR-145 в образцах рака толстой кишки. Материалом для исследования служили образцы опухоли, полученные от 45 больных раком толстой кишки, проходивших лечение в ГНЦ колопроктологии. Ни один из больных до операции не подвергался хи-мио- или лучевой терапии. Клинические данные

Гзсударственный научный центр кoлoпрoкmoлoгии Минздрава Poœuu, Мocква E-mail: npospekhova@mail.ru

пациентов и характеристики опухолей приведены в табл. 1. ДНК из ткани опухоли выделяли с использованием набора ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА ("ДНК-технология", Россия) согласно протоколу производителя. Образцы ткани, взятые под контролем врача-патоморфолога в максимально короткое время после резекции кишки (не более 30 мин), помещали в лизирующий раствор, и затем из них выделяли тотальную РНК с помощью набора PureLink RNA Mini Kit ("Ambion", США) по протоколу производителя. Соматические мутации в генах KRAS (экзоны 2—4) и BRAF (экзон 15, V600E) определяли с помощью ПЦР на амплифи-каторе Терцик ("ДНК-технология") с последующим секвенированием по двум комплементарным цепям на приборе ABI PRISM 3500 (8 capillaries, "Applied Biosystems", США). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя набор TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit ("Applied Biosystems"). Уровень экспрессии микроРНК miR-200c и miR-145 измеряли методом ПЦР в реальном времени с помощью наборов TaqMan MicroRNA assays ("Applied Biosystems"). Нормализацию полученных значений Ct для исследуемых микроРНК проводили по Ct RNU48. Уровень экспрессии рассчитывали, используя метод 2-ACt.

Изучаемые образцы КРР также были охарактеризованы по реализации в них программы эпи-телиально-мезенхимального перехода (ЭМП) [2]. После выделения тотальной РНК проводили реакцию обратной транскрипции, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase ("Promega",

Таблица 1. Клинические данные пациентов и характеристики опухолей

Характеристики

Средний возраст (мин.—макс.) 63.1 (26—81)

Мужчины/женщины 18/27

Локализация опухоли:

Прямая кишка 6

Левые отделы 22

Правые отделы 17

Стадия рака:

1-11 (Т1-4ШМ0) 21

III (Т1-4Ш-2М0) 9

IV (Т1-4Ш-2М1) 2

IV (Т1-4Ш-2М1, канцероматоз) 13

Степень дифференцировки:

Умереннодифференцированные G2 25

Низкодифференцированные 20

и слизистые G3

США), по протоколу производителя. Уровень экспрессии 5 генов - ZEB1, ZEB2, CDH1, VIM, SNAI1 — измеряли методом ПЦР в реальном времени с помощью прибора StepOnePlus ("Applied Biosystems"). Условия проведения ПЦР — объем смеси 20 мкл, состав: 100—200 нг кДНК, по 10 пкМ специфичных для каждого гена прайме-ров, 2 мМ dNTP, 0.5 е.а. Taq-полимеразы ("Сиб-Энзим", Россия), буфер для ПЦР, краситель EvaGreen. Изменение уровня экспрессии гена оценивали по разнице значений порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена в опухоли и в нормальной слизистой оболочке кишки методом AACt. Нормализацию получен-

ных значений Ct для исследуемых генов проводили по Ct генов контроля. Использовали два гена контроля — GAPDH, TFRC. Опухоли с повышенным относительно нормы (более чем в 2 раза) уровнем экспрессии ZEB1, ZEB2, VIM, SNAI1 и сниженной экспрессией CDH1 считали ЭМП-по-зитивными. Опухоли со сниженным или неизмененным уровнем экспрессии ZEB1, ZEB2, VIM, SNAI1 считали ЭМП-негативными. В результате исследуемые 45 образцов образовали 2 группы: ЭМП-позитивные (n = 13) и ЭМП-негативные опухоли (n = 32).

Статистический анализ выполняли с помощью программы Statistica 10.0 ("Statsoft Inc.", США). Использовали критерий U Вилкоксона— Манна—Уитни и критерий х2.

Методом ПЦР в реальном времени мы проанализировали экспрессию двух микроРНК — miR-200c и miR-145 — в образцах КРР (n = 45), гетерогенного по классификации TNM, морфологическим характеристикам и наличию перитонеального канцероматоза. Экспрессия изученных мик-роРНК в опухолях относительно референса была гетерогенна, варьировалась в широких пределах и была специфична для каждого отдельного пациента. Медиана относительных значений экспрессии составила для miR-200c — 0.557 (диапазон 0.0012—51.15) и для miR-145 — 0.82 (0.023— 119.84), рис. 1. Чтобы оценить клиническую значимость этих результатов, мы исследовали наличие возможной ассоциации уровня экспрессии обеих микроРНК с клинико-патологическими данными, такими как возраст, пол, локализация, стадия развития опухоли, степень ее дифферен-цировки. Мы не обнаружили значимых ассоциаций между этими показателями и экспрессией miR-145, однако для miR-200c была выявлена существенная связь со степенью дифференцировки опухоли. Экспрессия miR-200c была значительно

5.0 4.5 4.0 3.5

2 3.0 4

1 2.5

£ 2.0 1.5 1.0 0.5 0

—0.5

Медиана □ 25%—75% I Диапазон без выбросов

2.0 1.8 1.6 1.4

о 1.2

0

Ч 1.0 cd

0.6 0.4 0.2

0

—0.2

Медиана - □ 25%—75% Диапазон без выбросов

Рис. 1. Относительные значения экспрессии miR-145 и miR-200c в исследованных образцах КРР.

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ микроРНК miR-200c И miR-145

493

ниже в опухолях G3 (слизистые и низкодиффе-ренцированные аденокарциномы), медиана относительной экспрессии в них составила 0.23 (0.001—0.5), тогда как для опухолей G2 — 0.71 (0.13—51.l), р = 0.0009 по критерию U (рис. 2).

Образцы КРР были охарактеризованы нами по реализации в них программы ЭМП, приводящей к трансформации эпителиального фенотипа клеток в мезенхимальный фенотип [2]. В результате анализа экспрессионного профиля 5 генов (ZEB1, ZEB2, CDH1, VIM, SNAI1) исследуемые 45 образцов разделились на 2 группы: ЭМП-позитивные (n = 13) опухоли мезенхимального подтипа и ЭМП-негативные опухоли эпителиального подтипа (n = 32), табл. 2. Экспрессию микроРНК исследовали в каждой из этих групп, результаты представлены на рис. 2. Анализ данных показал значимое снижение уровня miR-200c в ЭМП-по-зитивных образцах по сравнению с ЭМП-нега-тивными опухолями (медиана относительной экспрессии равна 0.25 и 0.64 соответственно, р = = 0.019 по критерию U). И, наоборот, мы зарегистрировали повышение экспрессии miR-145 при наличии ЭМП (медиана относительной экспрессии — 2.1 и 0.61 соответственно, р = 0.034 по критерию U), рис. 3.

Таким образом, мы показали, что наблюдается корреляция низких значений экспрессии miR-200c с наличием ЭМП в опухоли. Полученные нами данные соответствуют результатам других авторов о функциональных свойствах этой мик-роРНК. Например, известно [3, 4], что одним из генов-мишеней для miR-200c является ZEB1, кодирующий транскрипционный фактор, который играет одну из ключевых ролей в развитии процесса ЭМП в раковых клетках [5—7]. При этом показано, что в криптах нормальной слизистой толстой кишки (эпителия) и стромы (мезенхимы) локус, включающий ген miR-200c, уже является неметилированным

1.6 1.4 1.2

о 1.0

0

4 0.8 iR-

S0.6 0.4 0.2

0

Медиана 125%-75%

G3

G2

Рис. 2. Относительные значения экспрессии ш1К-200с в образцах КРР разной степени дифференцировки.

в эпителии и метилированным — в мезенхиме. А в процессе канцерогенеза наблюдается селективное гиперметилирование гена miR-200с в эпителиальном компоненте [9]. В отсутствие miR-200c повышенная экспрессия ZEB1, который, в свою очередь, репрессирует CDH1, приводит к повышенной способности опухолевых клеток к миграции и инвазии. Именно такими свойствами обладают клетки КРР мезенхимального подтипа. Недавняя работа [10], выполненная с использованием лазерного микродиссектора, демонстрирует, что семейство miR-200 и, в частности, miR-200с супрессируется в инвазивном фронте колоректальных аденокарцином. Поскольку микроРНК этого семейства являются одними из важнейших регуляторов процесса ЭМП, потеря их экспрессии в инвазивной части адено-карцином также свидетельствует в пользу концепции, что ЭМП лежит в основе опухолевой инвазии.

1.6

1.4

1.2

c 1.0

0

200.8

ей

£ 0.6

0.4

0.2

0

Медиана 125%—75%

p = 0.0009

EMT

No EMT

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

5 4 1.6

- 1.4

ей 1.2

H 1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Медиана I 25%—75%

p = 0.034

EMT

No EMT

Рис. 3. Относительные значения экспрессии ш1Я-145 и ш1Я-200с в образцах КРР разных подтипов.

Таблица 2. Характеристики двух подтипов опухолей

Характеристики ЭМП-позитив-ные опухоли (п = 13) ЭМП-негатив-ные опухоли (п = 32)

Стадия рака:

1—111 5 25

IV (отдаленные

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком