научная статья по теме АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА PEANUT С ПОМОЩЬЮ RNAI В ООГЕНЕЗЕ ДРОЗОФИЛЫ Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА PEANUT С ПОМОЩЬЮ RNAI В ООГЕНЕЗЕ ДРОЗОФИЛЫ»

ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 9, с. 991-999

^=ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА

УДК 575.164:576.371:576.7

АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА peanut С ПОМОЩЬЮ RNAi В ООГЕНЕЗЕ ДРОЗОФИЛЫ

© 2015 г. К. А. Ахметова1, 2, 3, Н. В. Дорогова1, И. Н. Чесноков2, С. А. Федорова1, 3

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090

e-mail: fsveta@bionet.nsc.ru

2Университет Алабамы в Бирмингеме, отдел биохимии и молекулярной генетики, Бирмингем 35294, США 3Новосибирский государственный университет, кафедра цитологии и генетики, Новосибирск 630090

Поступила в редакцию 18.12.2014 г.

Исследованы функции гена peanut в оогенезе Drosophila melanogaster. Показано, что подавление экспрессии peanut при помощи РНК-интерференции в фолликулярных клетках яичника приводит к нарушению поляризации ооцита, аномальному цитокинезу в клетках хориона и нарушению конденсации хроматина в фолликулярных клетках. У самок со сниженной экспрессией гена peanut или отсутствием белка Pnut в генеративных клетках яичников нарушений оогенеза не наблюдалось. Однако эмбрионы, продуцируемые такими самками, имели сниженную выживаемость, обусловленную двумя пиками гибели.

DOI: 10.7868/S0016675815090027

Септины представляют собой группу консервативных ГТФаз, изначально открытых как белки, мутации генов в которых приводят к нарушениям цитокинеза. На сегодняшний день септины найдены у всех эукариот, за исключением высших растений, у которых принцип цитокинеза отличается от такового у животных и грибов. Хотя септины были идентифицированы у дрожжевых мутантов по клеточному циклу с нарушением цитокинеза, в настоящее время точно известно, что эти белки участвуют помимо цитокинеза во множестве других функций, таких как клеточная полярность и клеточное движение, функционирование микротрубочкового и актинового цитоске-лета, везикулярный трафик, экзоцитоз, апоптоз и др. [1, 2]. Для млекопитающих была установлена связь между мутациями и делециями септи-новых генов и стерильностью, нейромышечными заболеваниями и болезнями крови [3].

У дрозофилы известно пять представителей данного семейства — Pnut, Sepl, Sep2, Sep4 и Sep5. Септин, кодируемый геном peanut (pnut), участвует в цитокинезе соматических клеток [4]. Ранее мы показали, что мутации по данному гену, помимо цитокинеза, также вызывают нарушение сегрегации хромосом, что приводит к аномалиям плоидности в соматических клетках, однако не затрагивают пролиферацию генеративных клеток в сперматогенезе [5]. Недавно появились данные, что белок SEPT7, гомолог Pnut у млекопитающих, необходим для нормального протекания

мейоза в ооцитах мышей [6]. В данной работе изучены функции гена peanut в оогенезе дрозофилы.

Оогенез Drosophila melanogaster представляет собой сложный процесс скоординированного развития половых и соматических клеток, результатом которого является формирование зрелого яйца. В переднем отделе яичника, гермарии, происходит асимметричное деление генеративных стволовых клеток, в результате которого образуется цистобласт. Цистобласт проходит через четыре раунда митоза, образуя цисту из 16 половых клеток, одна из которых станет ооцитом, а 15 — трофоцитами (питающими клетками). В ходе этих предмейотических делений цитокинез неполный, поэтому 16 клеток цисты остаются соединены кольцевыми каналами и имеют общую цитоплазму [7]. Каждое деление клеток цисты сопровождается ростом и разветвлением специфической мембрано-цитоскелетной органеллы — фу-зомы (fusome), с помощью которой осуществляется первичная поляризация цисты и определяется, какая из 16 клеток станет ооцитом. Также фузома обеспечивает селективный транспорт различных веществ из питающих клеток в ооцит [8, 9].

Во втором отделе гермария каждая циста обволакивается эпителиальными фолликулярными клетками соматического происхождения, образуя яйцевую камеру, или фолликул. Соседние фолликулы отделяются друг от друга при помощи интерфолликулярных клеток. Каждый гермарий с примыкающими к нему последовательно расположенными развивающимися яйцевыми камера-

ми образует овариолу. Яичник взрослой мухи состоит из 16—20 овариол, обособленных друг от друга клетками туники, которые способны сокращаться и продвигать созревающие фолликулы к яйцеводу.

Так как гомозиготы по сильным мутациям pnut не доживают до стадии имаго, для изучения оогене-за использовались комбинации сильных мутаций с гипоморфными аллелями pnut, а также подавление экспрессии гена при помощи РНК-интерференции. Эктопическое подавление экспрессии гена pnut в различных типах клеток позволило разделить функции гена в соматической и генеративной составляющей яичников дрозофилы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения гибридной плазмиды pUASP-W, содержащей функциональную часть плазмиды pWIZ [10], соответствующий участок pWIZ размером 80 пн (интрон гена white) был амплифици-рован с использованием праймеров 5'-TGC-CCGTGGGGTTTGAAT-3' и 5'-GTCTAGAT-TATAAGCTAGCTGAGTTTCA-3' и встроен в плазмиду pUASP по сайтам рестрикции NotI и XbaI. Для получения конструкции для РНК-интерференции гена pnut участок этого гена размером 1000 пн был амплифицирован с помощью праймеров 5'-GGGTACCAACACCATCATCGA-3' и 5'-TGCTGGTGTGTGTTCGGG-3' и встроен в pUASP-W по обеим сторонам от интрона гена white в обратной ориентации. Наличие интрона между двумя копиями участка гена pnut облегчало формирование шпильки в матричной РНК, считываемой с этого конструкта и ее дальнейшее разрезание [10]. Нуклеотидная последовательность ДНК встройки контролировалась в Центре автоматического секвенирования "Геномика" СО РАН. Трансформация зародышевой линии дрозофилы проводилась согласно описаной ранее методике [11]. Была получена трансгенная линия дрозофилы с инсерцией трансгена pUAS P-W-pnut_RNAi в III хромосому.

В качестве контроля использовали линию Drosophila melanogaster дикого типа Hikone AW из фонда лаборатории генетики клеточного цикла. Аллели pnut, использованные в работе, были представлены следующими линиями из стокового центра в Блуминтоне (США): № 5687: pnutXP/T(2;3)SM6a-TM6B, Tb1; № 11194: cn1 P{PZ}pnut02S02/CyO; ry506; № 21071: y1 w67c23; P{wHy}pnutDG05807. Для проведения РНК-интерференции гена sep2 использовалась линия № 28004: y1 v1; P{ TRiP.JF02838}attP2. Для запуска РНК-интерференции генов pnut и sep2 мух линии № 28004 (sep2-RNAi) или содержащих трансген pUASP-W-pnut RNAi скрещивали с GAL4 драйверами. Принцип UAS-GAL4 системы был описан ранее

[12]. В работе использовался экспрессирующийся во всех типах клеток драйвер Actin5c-GAL4, специфичный для генеративных клеток драйвер nanos-GAL4, а также набор драйверов с соматической экспрессией, работающих на различных стадиях оогенеза и/или в различных типах клеток яичников. Описание драйверов представлено в табл. 1.

Для окраски на Р-галактозидазу органы дрозофилы извлекали в растворе Хэнкса, фиксировали в 0.75%-ном глутаровом альдегиде, приготовленном на 0.1 M натрий-какодилатном буфере в течение 20 мин при комнатной температуре, отмывали от фиксатора в PBS-буфере и окрашивали в течение 2—16 ч красящим раствором, содержащим 0.2% X-gal. Для остановки реакции окрашивания препарат промывали водой и переносили в 30%-ный глицерин.

Для приготовления препаратов яичников дрозофилы, окрашенных по DAPI, изолированные в растворе Хэнкса яичники фиксировали в течение 20 мин в 4%-ном растворе формальдегида, отмывали в PBS, красили DAPI и заключали в 20%-ный глицерин. Микроскопический анализ проводили в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН на микроскопах Axioscope 2 plus и LSM 510 Meta (Zeiss).

Для определения стадии гибели эмбрионов яйца, отложенные в течение 1 ч, собирали и помещали на предметное стекло в каплю галокарбоно-вого масла. Стекла с эмбрионами держали во влажной камере при 25°С, стадии развития эмбрионов определяли по Фое [13] под бинокулярной лупой в проходящем свете.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ паттерна экспрессии гена pnut

Паттерн экспрессии гена pnut в яичниках дрозофилы анализировали при помощи репортерно-го гена Р-галактозидазы. Линия pnut02502 имеет ин-серцию Р-элемента P{ry + t7.2 = PZ} со встроенным репортерным геном Р-галактозидазы в 5'-некодирующей области гена pnut, что позволяет оценить паттерн экспрессии данного гена (рис. 1). В яичниках дрозофилы окраска на Р-галактози-дазу выявляется на стадии имаго в ранних яйцевых камерах — в зоне гермария, где происходит обволакивание будущих цист фолликулярными клетками, в поздних яйцевых камерах — в ядрах питающих клеток и фолликулярных клеток, образующих оболочку яйцевой камеры, и в формирующемся яйце в ядрах клеток хориона (оболочки эмбриона), а также области дорзальных выростов. Необходимо отметить, что наблюдаемая окраска клеточных ядер обусловлена наличием сигнала внутриядерной локализации в репортерном белке.

Таблица 1. Анализ аномалий оогенеза при эктопическом подавлении экспрессии генов рпШ и звр2 в оогенезе дрозофилы

Драйвер Область экспрессии рпЫ-КШЛ1 авр2-ШЛ1

3731 Интерфолликулярные клетки (ИФ) Отсутствие ИФ в некоторых яйцевых камерах Отсутствие ИФ во многих яйцевых камерах

6989 Клетки терминального филамента (ТФ) гермария Отсутствие ТФ в некоторых яйцевых камерах Отсутствие ТФ в некоторых яйцевых камерах

7023 Клетки ТФ, фолликулярные клетки (ФК) 2—3 районов гермария, ФК яйцевых камер на 1-й стадии развития, ИФ Отсутствие ИФ в некоторых яйцевых камерах, нарушение полярности яйцевых камер Отсутствие ИФ в яйцевых камерах, нарушение полярности яйцевых камер

7024 ИФ, ФК яйцевых камер на 1-3-й стадиях развития, клетки бластодермы в эмбриогенезе Отсутствие ИФ в некоторых яйцевых камерах, нарушение полярности яйцевых камер Эмбриональная гибель

4937 (папв$-0АЬ4) Генеративные клетки Оогенез нормальный Генетический конструкт $ер2-КЫЛ1 не запускается в клетках зародышевого пути

4414 (А&т5с-0ЛЬ4) Повсеместная экспрессия Отсутствие ИФ в некоторых яйцевых камерах, нарушение полярности яйцевых камер, нарушение цитокинеза в клетках хориона Гибель на 1-м личиночном возрасте

Примечание. Номер драйвера соответствует номеру линии в стоковом цент

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком