ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 2, с. 262-271
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.17:599.9
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ТУБЕРКУЛЕЗУ
ЛЕГКИХ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
© 2010 г. О. А. Гра1, 2, Ж. М. Кожекбаева2, 3, О. И. Скотникова4, В. И. Литвинов4, Т. В. Наседкина1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991;
e-mail: olgagra@gmail.com 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 3University of Miami Miller School of Medicine Institute for Human Genomics, Miami, Florida 33177
4Московский научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения Москвы,
Москва 107564
Поступила в редакцию 09.04.2009 г.
Заболеваемость туберкулезом (ТБ) остается одной из важных проблем здравоохранения. Есть данные, что предрасположенность к инфекционным заболеваниям, в том числе к туберкулезу, зависит от генетического статуса. Для определения генетических факторов риска развития ТБ с помощью аллель-специфичной гибридизации на биочипе определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1 у 73 больных ТБ и 352 здоровых индивидов. У больных ТБ обнаружено увеличение частоты "нулевого" GSTT1 генотипа (OR = 3.26, 95% CI = 1.91-5.55, p = 0.000028) и двойного "нулевого" GSTT1/GSTM1 генотипа (OR= 4.05, 95% CI = 2.14-7.65, p = 0.000034) по сравнению с группой здоровых доноров. Впервые показано, что у больных ТБ генотип NAT2* 5/* 5 в сочетании с "нулевым" GSTT1 и двойным "нулевым" GSTT1/GSTM1 генотипами встречается достоверно чаще, чем в контроле. Таким образом, изученные полиморфные варианты генов GSTT1, GSTM1 и NAT2 могут потенциально модулировать риск развития ТБ у этнических русских и представляют интерес для дальнейших исследований на больших выборках.
Туберкулез (ТБ) — это инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis, МБТ) и характеризующееся развитием клеточной аллергии и специфических гранулем в различных тканях и органах [1].
В настоящее время ТБ занимает первое место среди причин смерти от инфекционных заболеваний. В мире ежегодно регистрируется около 8 млн. новых случаев заболевания ТБ органов дыхания, и прогноз дальнейшей динамики эпидемической ситуации остается неблагоприятным. В России эпидемиологическая ситуация по ТБ также остается напряженной: заболеваемость по итогам 2007 г. составила 83.2 на 100000 населения, распространенность — 194.5 на 100000 населения, смертность — 21.3 на 100000 населения [2]. Данное заболевание является социально зависимым, при этом на развитие ТБ влияют как неблагоприятные условия внешней среды, так и индивидуальные характеристики организма индивида.
На сегодняшний день подтверждена гипотеза, что предрасположенность к инфекционным заболеваниям зависит от эффективности активации клеточного иммунитета и определяется генетическим статусом. В частности, подтверждена
гипотеза о том, что генетическая предрасположенность к ТБ может быть обусловлена наличием полиморфизма в генах индивида, ответственных за естественный иммунитет к инфекциям. Так, показано, что носители распространенных производных аллелей генов семейства Toll-подобных рецепторов, которые отвечают за распознавание и элиминацию бактерий и вирусов, более подвержены развитию ТБ, чем индивиды, носители предковых аллелей [3, 4]. Наличие производного аллеля —336G в промотерной области гена CD209, кодирующего мембран-связанный распознающий рецептор DC-SIGN (замена —336A>G), напротив, обусловливает снижение экспрессии CD209 и концентрации рецептора DC-SIGN и, тем самым, определяет протективное действие в отношении ТБ в целом и кавернозной формы ТБ в частности [5]. Также нельзя не отметить ключевую роль генов цитокинов, белковые продукты которых участвуют в формировании гранулемы, а также в контроле внутриклеточного роста МБТ и распространении бацилл [6, 7]. Кроме того, следует отдельно остановиться на гене NRAMP1 (SLC11A1), который кодирует специфичный для макрофагов мембранный белок-переносчик, необходимый для активации макрофагального зве-
на иммунного ответа и раннего уничтожения внутриклеточных патогенов, тем самым обусловливающий устойчивость к ТБ в период непосредственно после первичного инфицирования [8, 9].
Многочисленные молекулярно-генетические исследования, сочетающие в себе возможности методов кандидатного и позиционного картирования, позволили локализовать гены-кандидаты предрасположенности к ТБ на 2-й, 6-й, 15-й, 17-й, 20-й и Х-хромосомах [8—12]. Однако, несмотря на активное изучение генетической составляющей в этиологии ТБ, на сегодняшний день известны далеко не все гены, аллели которых определяют предрасположенность к данному инфекционному заболеванию.
Получены результаты, что факторами риска развития ТБ помимо сниженных показателей иммунного статуса являются курение и неблагоприятные условия окружающей среды [13, 14]. В связи с этим помимо уже известных генов кандидатов предрасположенности к ТБ становится актуальным изучение генов, белковые продукты которых участвуют в метаболизме ряда ксенобиотиков (в том числе компонентов табачного дыма), т.е. анализ полиморфизма генов системы биотрансформации. О важности изучения функционального состояния ферментов системы биотрансформации при ТБ свидетельствуют также результаты ряда работ, в которых показано, что негативное воздействие факторов внешней среды и наличие определенных аллелей некоторых генов системы биотрансформации являются факторами риска развития обструктивных болезней легких и заболеваний верхних дыхательных путей, при этом данные патологические состояния часто сочетаются с ТБ [15—18].
Для проведения исследования нами были выбраны гены системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1, белковые продукты которых играют важную роль в метаболизме широкого круга как ксенобиотиков, так и эндогенных субстратов. Гены CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9и CYP2C19 кодируют ферменты I фазы биотрансформации; гены GSTT1, GSTM1 и NAT2 — ферменты II фазы биотрансформации; ген MDR1 кодирует P-глико-протеин — важнейший белок-транспортер, участвующий в выведении продуктов метаболизма из клетки в III фазе биотрансформации; а также ген NRAMP1, который кодирует макрофагальный белок-переносчик, ассоциированный с естественной устойчивостью к инфекции [19, 20].
Для выяснения роли генов системы биотрансформации в развитии ТБ в настоящей работе определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, GSTT1, GSTM1, NAT2, MDR1 и NRAMP1 у 73 больных ТБ и проведено сравнение с частотами полиморфных вариантов данных генов у 352 здоровых ин-
дивидов — представителей этнически гомогенной популяции русских.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты. Обследовано 73 пациента с диагнозом ТБ в возрасте от 19 до 82 лет (64.4% мужчины), из которых 31 больной был с инфильтративным ТБ, 19 — с фиброзно-кавернозным, 9 — с диссеми-нированным, 6 — с экссудативным плевритом, 4 — с очаговым ТБ, 2 — с туберкулемой и 2 — с ТБ внут-ригрудных лимфатических узлов. Диагностика ТБ и определение конкретной формы заболевания основывались на данных клинического и рентгенологического исследований. Все пациенты с диагнозом ТБ находились на лечении в отделениях Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ) с 2006 г.
В качестве контрольной группы были протестированы 352 неродственных здоровых индивида (диапазон возраста от 20 до 65 лет, 48.6% мужчины). В эту группу вошли студенты Московского государственного открытого университета (МГОУ), сотрудники Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и сотрудники Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (ИОГен РАН), не имеющие легочной патологии.
Все пациенты и здоровые доноры являются жителями европейской части России и представлены этнически гомогенной популяцией русских. Весь материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия.
Исследуемые образцы. В работе использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови с помощью набора Wizard genomic DNA purification system ("Promega", США) или из слюны с использованием набора реагентов для выделения Oragene™ DNA Self-Collection Kit ("DNA Genotek", Канада).
Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Нуклеотидные последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов, представляющие собой полиморфные участки генов NRAMP1 (C274T) и MDR1 (C3435T), приведены в табл. 1. Последовательности остальных иммобилизованных олигонуклео-тидов опубликованы ранее [21].
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для наработки фрагментов ДНК использовали двухэтапную мультиплексную ПЦР. Прай-меры подбирали с использованием программы Oligo 6 (Molecular Biology Insights, США). Типы изученных мутаций и последовательности прай-меров для полиморфных участков генов NRAMP1
NAT2 NRAMP1 MDR1 GSTT1 GSTM1
341T 481C 590G 857G 274C 3435C + +
341T 481C 590G 857G 274C 3435C + +
341C 481T 590A 857A 274T 3435T - -
341C 481T 590A 857A 274T 3435T - -
CYP1A1
--^ CYP2D6 CYP2C9 CYP2C19
C4887A и A4889G T6235C >-А-v-^-v-л-\
CCATT ACATT 6235T 1934G 430C 1075A 681G
CCATT ACATT 6235T 1934G 430C 1075A 681G
CCGTT ACGTT 6235C 1934A 430T 1075C 681A
CCGTT ACGTT 6235C 1934A 430T 1075C 681A
Рис. 1. Схема олигонуклеотидного биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации и выявления генетической предрасположенности к ТБ. Пояснение в тексте.
(С274Т) и MDR1 (С3435Т) приведены в табл. 1. Для амплификации остальных генов системы биотрансформации использовали праймеры, последовательности которых опубликованы ранее [21].
Изучаемые гены были объединены в группы, соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе. В группу 1 вошли гены: CYP1A1 (4887С>А, 4889Л>0 и 6235Т>С) и CYP2D6 (1934С>Л); в группу 2 - G
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.