ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2014, том 48, № 2, с. 100-103
РАДИАЦИОННАЯ ХИМИЯ =
УДК 541.15
АНАЛИЗ ХИТОЗАНА МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩЕЙ ХРОМАТОГРАФИИ © 2014 г. К. Зелинска*, **, А. Г. Шостенко*, С. Трушковский*
*Химический факультет, Университет им. Н. Коперника Польша, 87100 Торунь, ул. Гагарина, 11 **Лаборатория ядерных реакций им. Г.Н. Флерова, Объединенный институт ядерных исследований 141980, Московская обл., Дубна, ул. Жолио-Кюри, 6 E-mail: kziel@jinr.ru Поступила в редакцию 18.09.2013 г. В окончательном виде 07.10.2013 г.
Исследовано влияние у-излучения на среднемолекулярную массу и молекулярно-массовое распределение хитозана. Анализ образцов методом гель-проникающей хроматографии (GPC/SEC) показал, что с ростом дозы облучения уменьшается количество высокомолекулярных фракций и возрастает количество фракций содержающих низкомолекулярные хитозаны (<50 кДа). Радиационно-хи-мический выход деструкции составляет 11.0 частиц/100 эВ.
DOI: 10.7868/S0023119714020148
Катионные полимеры широко используются в генной терапии в качестве невирусных векторов переноса генов. В противоположность синтетическим полимерам хитозан характеризуется нетоксичностью и биодеградируемостью. По этой причине как он, так и его производные являются перспективными кандидатами для конструриро-вания ДНК-связывающих полимеров. Использование хитозана в биомедицине ограничено из-за его высокой молекулярной массы, определяющей плохую растворимость в воде при нейтральных рН [1—6]. В настоящее время важной задачей оказывается фракционование полимера и определение зависимости между его молекулярной массой и эффективностью трансфекции комплексов ДНК-хитозан [7]. Установлено, что олигомеры с молекулярной массой около 4.7 кДа формируют стабильные комплексы с переносимой ДНК, что задерживает ее освобождение. Олигомеры хитозана с молекулярной массой меньше чем 2.7 кДа формируют нестабильные комплексы ДНК-хи-тозан, которые не эффективны при трансфек-ции [2]. Хорошую функцию носителей генов исполняют комплексы на базе молекул олигохито-зана с молекулярной массой 10—150 кДа [8].
Известно [9—11] использование трех методов уменьшения молекулярной массы хитозана: гидролитическая, радиационная и энзиматическая деструкции. При этом при у-облучении полимерные цепи рвутся статистически, и снижается молекулярная масса и полидисперсность. В процессах гидролитической и энзиматической деструкции изменение молекулярной массы зависит от длины цепи хитозана [11].
Определено влияние дозы облучения на сред-нечисленную Mn и среднемассовую Mw молекулярную массу, а также индекс полидисперсности (Mw/Mn) полимера.
МЕТОДИКА
Облучение хитозана в твердом состоянии проводили на радиационной установке РХМ-у-20 в атмосфере азота при температуре 25°C. Мощность дозы излучения, 65 Гр/ч, измеряли по методу Фрикке [10].
Среднемолекулярную массу и индекс полидисперсности полимера определяли методом GPC/SEC. Для исследований использовали жидкостной хроматограф HP 1050, оборудованный рефрактометрическим детектором HP 1047. Хрома-тографические параметры: скорость протекания жидкости (0.3 M CH3COOH + 0.2 M CH3COONa + + H2O) — 0.8 мл/мин, температура колонки — 30°C, обьем пробы — 100 мкл. Для калибровки колонок PL aquagel-OH Mixed (300 мм) и PL aquagel guard (Polymer Laboratories) использовали стандарты PEO/PEG с навеской 1970-1345000 г/моль.
Приготовление образца хитозана включало растворение 4 мкг полимера в 10 мл жидкости с последующим фильтрованием раствора через шпри-цовый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Снижение среднечисленной и среднемассовой молекулярной массы хитозана с увеличением дозы
АНАЛИЗ ХИТОЗАНА МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩЕЙ ХРОМАТОГРАФИИ
101
л ч о
20
40
60
80
Доза, кГр
100
120
140
160
Рис. 1. Зависимость среднечисленной молекулярной массы хитозана (а), разности —---— (б) от дозы облучения поМ М„
лимера.
0
(рис. 1) означает, что доминирующим процессом, происходящим при облучении полимера, является деструкция.
Исследования [10] на основе измерения вязкости растворов хитозана позволили установить, что в результате разрыва связей полимера возникают макромолекулы с цепью более короткой, чем перед облучением. Знание среднечисленной и сред-немассой молекулярной массы позволило точно определить радиационно-химический выход деструкции полимера без необходимости принятия упрощений. Радиационно-химический выход деструкции полимера бф = 11.0 частиц/100 эВ рассчитан на основе уравнений (1) и (2) [12]:
М мПп (8) х)^оотУд,
- _1_ = Г^ - о
М„ ^ 2
(хУ 100
(1)
(2)
где Мп и Мп — текущая и исходная среднечислен-ная молекулярная масса; М№ и М^ — текущая и
исходная среднемассовая молекулярная масса; б(Х) — радиационно-химический выход сшива-
ния; Б — доза облучения, эВ/г; МА — число Авога-
дро. Зависимость — — —-— от дозы облучения
Мп МПо
представлена на рис. 1. Аналогичная зависимость наблюдаетса для —--—. Большой индекс по-
Mw MWо
лидисперсности необлученного хитозана Мж/Мп = = 3.8 (табл. 1) указывает, что в образце множество фракций в широком диапазоде молекулярных масс. Снижение индекса полидисперсности с ростом дозы указывает на уменьшение количества фракций. Молекулярно-массовое распределение образца необлученного и облученного дозами 25, 71, 101 и 152 кГр представлено на рис. 2.
Таблица 1. Индекс полидисперсности (Мж/Мп) образцов хитозана
Доза, кГр М«/Мп
0 3.8
25 2.7
71 2.4
101 2.4
152 2.1
102
ЗЕЛИНСКА и др.
м
Рис. 2. Молекулярно-массовое распределение необлученного (1) и облученного дозами, кГр (2 - 25; 3 - 71; 4 - 101; 5 -152) хитозана.
6
2
3
4
5
Использование метода ОРС/8БС сделало возможным определение процентного содержания олигохитозана по молекулярной массе (табл. 2). Видно, что высокомолекулярные фракции (400— 800 и >800 кДа) присутствуют только в необлучен-ном образце полимера. Облучение хитозана дозой 25 кГр вызывает исчезновение упомянутых выше фракций. Применение более высоких доз 71 и 101 кГр приводит к исчезновению фракции
Таблица 2. Содержание фракций хитозана до и после облучения
Содержание фракций хитозана, %
м, кДа 0 25 71 101 152
кГр
<5 1 4 11 15 34
5-50 19 57 76 77 65
50-100 18 24 11 7 1
100-200 27 13 2 1 -
200-400 23 2 - - -
400-800 10 - - - -
>800 2 - - - -
200—400 кДа, доза 152 кГр — к исчезновению фракции 100—200 кДа. Процентное содержание низкомолекулярных фракций (<5 и 5—50 кДа) с ростом дозы возрастает.
Полученные результаты свидетельстуют о том, что деструкция под воздействием у-излучения протекает путем статистического разрыва цепей. На основании этого можно сделать вывод, что процесс не зависит от структуры макромолекулы и химического состава полимерной цепи.
Работа выполнена при поддержке программы сотрудничества ОИЯИ — Республика Польша (приказ 62 от 11.02.2013, п.23) и гранта WCh-40/2011.
ВЫВОДЫ
Методом ОРС/8БС определено молекулярно-массовое распределение у-облученного хитозана. Радиационно-химический выход деструкции 11 разрывов цепи на 100 эВ свидетельствует о деструктивном характере у-радиолиза хитозана. Полученные данные по зависимости средней молекулярной массы от дозы облучения позволят оптимизировать процесс у-радиолиза хитозана и подобрать дозу для получения полимера с заданными свойствами.
АНАЛИЗ ХИТОЗАНА МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩЕЙ ХРОМАТОГРАФИИ
103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Köping-Höggärd M., Tubulecas I., Guan H., Edwards K., Nilsson M, Värum K.M., Artursson P. // Gene Therapy. 2001. V. 8. № 14. C. 1108.
2. Köping-Höggärd M, Värum K.M., Issa M, Danielsen S., Christensen B.E., Stokke B.T., Artursson P. // Gene Therapy. 2004. V. 11. № 19. C. 1441.
3. Занг К., Эрселен С., Тихонов В.Е., Караева С.З., Слита А.В., Зарубаев В.В., Мели И., Дюпортай Г., Ба-бак В.Г. // Рос. хим. журн. 2007. Т. LI. № 6. С. 81.
4. Mansouri S., Lavigne P., Corsi K., Benderdour M., Beaumont E., Fernandes J.C. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2004. V 57. № 1. C. 1.
5. Minhyung L., Jae-Woon N., Youngmin K., Jae J.K., Kyung S.K., Sung W.K. // Pharmaceutical Research. 2001. V. 18. № 4. C. 427.
6. Alamech M., Dejesus D., Jean M., Darras V., Thibault M., Lavertu M, Buschmann M.D., Merzouki A. // International Journal of Nanomedicine. 2012. V. 7. C. 1399.
7. Nguyen S, Hisiger S, Jolicoeur M, Winnik F.M., Buschmann M.D. // Carbohydrate Polymer. 2009. V. 75. № 4. C. 636.
8. Lavertu M, Methot S, Tran-Khanh N, Buschmann M.D. // Biomaterials. 2006. V 27. № 27. C. 4815.
9. Ocloo F.C.K., Adu-Guamf A., Quarcoo E.A., Serfor-Ar-mah Y, Asare D.K., Owulah C. // European Journal of Food Research & Review. 2012. V. 2. № 3. C. 69.
10. Zelinska K., Shostenko A.G., Truszkowski S. // High Energy Chemistry. 2009. V. 43. № 6. C. 445.
11. Boryniec S., Strobin G., StruszczykH., NiekraszewiczA., Kucharska M. // International Journal of Polymer Analysis and Characterization. 1997. V 3. № 4. C. 359.
12. Charlesby A. Atomic Radiation and Polymers. Oxford: Pergamon Press, 1960.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.