ГЕНЕТИКА, 2006, том 42, № 2, с. 192-197
^=ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАСТЕНИЙ
УДК 575.13:633.11
АНАЛИЗ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЭВОЛЮЦИОННО НЕСТАБИЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМА У РАСТЕНИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ
© 2006 г. Г. В. Мозгова1, П. А. Орлов1, Н. В. Шалыго2
1 Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072; факс: 375 (17) 284-19-17; e-mail: N.Trukhanovets@igc.bas-net.by 2 Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072; факс: 375 (17) 284-23-59; e-mail: shalygo@biobel.bas-net.by Поступила в редакцию 19.05.2005 г.
У дигаплоидных линий пшеницы проведено исследование двух эволюционно нестабильных областей хлоропластного генома, включающих гены, изменения в которых могут быть связаны с возникновением явления альбинизма в культуре пыльников: rbcL, кодирующий большую субъединицу Rubisco; psaA, продуктом которого является P700 апопротеин Ia; petA, кодирующий цитохром f; atpB и atpE, продуктом которых являются в- и е-субъединицы СБ1-комплекса АТФазы соответственно; trnE, кодирующий тРНК глутаминовой кислоты; а также ген cemA, кодирующий белок мембраны оболочки. С помощью ПЦР-анализа показано, что наиболее часто у исследованных дигаплоидных линий не выявлялся ген atpB. Полученные результаты позволяют предположить, что регенерация альбиносных растений сопровождается скорее всего делецией участка хлоропластной ДНК, включающего данный ген.
Альбинизм является одним из основных препятствий на пути использования культуры пыльников и изолированных микроспор как одного из самых быстрых современных методов для получения гомозиготных растений и экономически ценных сортов. Предполагают, что возможной причиной андрогенетического альбинизма у злаков является возникновение делеций в хлоропластной ДНК, происходящих вследствие того, что геном отцовских органелл деградирует в ходе развития пыльцы in vivo [1, 2]. Предобработка пыльников у одних сортов позволяет переключить гаметофитную программу развития пыльцы на спорофитную и остановить деградацию ДНК, у других - нет [3], следствием чего является формирование мутантного фенотипа. Было показано возникновение делеций ДНК пластид альбиносных растений, полученных путем каллусогенеза и прямого эмбриогенеза у пшеницы, риса и ячменя [4-6]. Вместе с тем исследования конкретных фотосинтетических генов, изменения в которых могли бы индуцировать альбинизм у растений, полученных путем прямого эмбриогенеза in vitro, не проводились. Кроме того, анализ структурных перестроек хлоропластной ДНК, происходящих в ходе прямого эмбриогенеза, был выполнен на малом количестве объектов, в основном на нескольких модельных сортах ячменя [6]. Поэтому целью нашей работы была оценка методом ПЦР возможности возникновения изменений ряда генов,
связанных с фотосинтезом, у альбиносных расте-ний-регенерантов, полученных в культуре пыльников разных дигаплоидных линий пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектом исследований служили четыре дигаплоидные линии мягкой пшеницы, полученные в лаборатории генетики морфогенеза Института генетики и цитологии НАНБ методом культуры пыльников межсортовых гибридов первого поколения: Циано х Диамант (БИ 83 (а х Б0), Китт х Скала (БИ 64 (К х Бк)), Скала х Красноярская (БИ 60 (Бк х Кг)), Диамант х х Инеа (БИ 38 (Б1 х 1п)). Растения выращивали на экспериментальном поле Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
Культура пыльников. Предобработку пыльников, их культивирование и регенерацию растений проводили в соответствии с ранее описанными методиками [7].
Выделение и амплификация ДНК. ДНК выделяли из 100 мг навески свежих листьев по методике Дорохова и Клоке [8]. Для очистки от РНК добавляли раствор РНКазы (на 1 мл раствора ДНК 50-100 мкг РНКазы; 10 мг/мл). Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре ИНгозрес 3300рго.
ПЦР проводили в четырех повторностях с использованием тотальной ДНК отдельных альби-
Иccлeдoвaнныe пластидные гены
Ген Пocлeдoвaтeльнocть ^aáMepoB Пpoдyкт гена Лoкaлизaция гена в xлopoплa-cтнoм гeнoмe Paзмep гена, нн Длина амнлифи-циpyeмoгo фpaгмeнтa, пн
psaA 5' 5' -CCAGAAGGTAATGGGTTACTCC-3' -GCCATTTCTCAAGAACACTAGC-3' P 700 aпoпpoтeин Ia 394б4-4171б 2252 2109
atpB 5' 5' -TTTCTGCGATTTGTTCTCCTCT-3' -GTACAGGTCGTATCGATCAAAT-3' ß-cyбъeдиницa CF1-кoмплeкca ATФaзы 52б31-54127 149б 1439
atpE 5' 5' -AATCCAATTGACAGCCTCGATT-3' -TGTACTGACTCCTAAGCGAATT-3' e-cyбъeдиницa CF1-кoмплeкca ATФaзы 52221-52б34 413 382
rbcL 5' 5' -ACTAAAGCAGGTGTTGGATTTA-3' -ATCAATAGTATCTACCGGCTCG-3' Бoльшaя cyбъeдиницa Rubisco 54910-5б343 1433 1410
cemA 5' 5' -GGTCTCTTCCTCATTTAACAAA-3' -GAATGATAAATGACTACAAGCG-3' Бeлoк мeмбpaны oбoлoчки 58б97-59389 б92 б12
petA 5' 5' -CTTGGGTAAAGGAACAGATAAC-3' -GTAATGGATCCTGAAGCACGAT-3' Цитoxpoм f 59б21-б0583 9б2 831
trnE 5' 5' -CCCTATCGTCTAGTGGTTCAGG-3' -GCTGCCTCCTTGAAAGAGAGAT-3' тРНК^ 15481-15553 72 4б
нocныx pacтeний чeтыpex гeнoтинoв. Кoнтpoлeм cлyжилa ДНК, выделенная из листьев зеленых pacтeний-peгeнepaнтoв, а также истодных диган-лoидныx линий. Oлигoнyклeoтидныe нpaймepы для ПЦР были выбpaны на ocнoвaнии нocлeдoвa-тeльнocтeй семи гeнoв xлopoнлacтнoй ДНК, жюн-cтpyиpoвaны с нoмoщью пpoгpaммы Gene Runner и cинтeзиpoвaны 3AO (Mocквa). ПЦР
нpoxoдилa в peaкциoннoй смеси oбъeмoм 25 мкл, coдepжaщeй 5 мкл ПЦP-бyфepa (б7 hM тpиc-HCl, pH 8.3; 17 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0.1%-ный твин-20, 0.12 мг/мл BSA, 8%-ный глицepoл), 200 мкM кaждoгo dNTP, 0.4 мкM кaждoгo пpaй-Mepa, 1.5 U Гag-нoлимepaзы и 10 нг гeнoмнoй ДНК. Aмплификaцию ДНК нpoвoдили в амнлификато-pe Thermal Cycler (Bio-Rad). ПЦР для гена trnE включала дeнaтypaцию пpи 940C (5 мин); далее 30 циктов нpи 940C (15 с), 520C (30 с), 720C (5 с); и заключитель^ю элoнгaцию пpи 720C (5 мин). Для идентификации ocra^^ix гeнoв иcнoльзoвaли cлeдyюшyю пpoгpaммy: дeнaтypaция - 940C (4 мин); 35 циктов нpи 940C (1 мин), 580C (1 мин), 720C (2 мин); элoнгaция нpи 720C (5 мин). Пpoдyкты peaкции амплификации paздeляли элeктpoфope-зoм в 3%^om (ген trnE) и 0.8%-нoм ^стальные гены) aгapoзнoм геле в 1 x TAE-бyфepe и фoтoдoкy-мeнтиpoвaли. Для oнpeдeлeния длины амплифици-poвaнныx фpaгмeнтoв иcнoльзoвaли мapкepы À, PstI и 100 нн + 1500 нн ("^бЭ^им", Hoвocибиpcк).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Пpи иccлeдoвaнии внyтpи- и мeжвидoвыx paз-личий пшениц и эгилoнcoв бьгго нoкaзaнo, чтo изменения cтpyктypы xлopoплacтнoй ДНК (деле-ции и инcepции) in vivo y них нaибoлee чacтo вcтpeчaютcя в нecкoлькиx yчacткax [9]. В oOTÓe^
ности подвержена аберрациям область размером 16 тпн, включающая гены гЬеЬ и реХА. Нами предполагалось, что структурные перестройки, которые могли бы быть причиной андрогенетическо-го альбинизма, происходят в таком эволюционно нестабильном участке с наибольшей частотой. Кроме того, он относится к ЬБС-области хлоро-пластного генома, в которой сконцентрирована основная масса фотосинтетических генов. Исследования изменений ДНК альбиносных растений методом ПЦР проводились в двух районах генома хлоропластов - Б и в ("горячие" области для структурных мутаций, по 0§Шага й а1. [9]). Для анализа аберраций из первой области были выбраны пять генов, участвующих в процессе фотосинтеза (таблица): ген гЬеЬ, кодирующий большую субъединицу ЯиЫзсо, гены компонентов ти-лакоидных мембран пластид (фотосистемы I -рзаА, цитохрома f - реХА, АТФсинтазы - МрБ и аХрЕ) и один ген, не связанный с фотосинтезом, который, однако, также мог подвергаться изменениям [9], - еетА, кодирующий белок мембраны оболочки хлоропласта. Для оценки изменений во второй области была проведена амплификация гена ХгпЕ. Продуктом данного гена является тРНК глутаминовой кислоты, которая необходима у высших растений для синтеза всех тетрапир-ролов, в том числе хлорофилла и гемма. Молекулярные массы исследуемых генов хлоропластной дНк и их фрагментов, амплифицируемых с помощью сконструированных праймеров, представлены в таблице.
Проведенный ПЦР-анализ выявил присутствие исследуемых генов хлоропластной ДНК в листьях всех зеленых растений, полученных методом культуры пыльников, а также донорных дигаплоидных линий. Размер всех амплифицируемых фрагмен-
пн
11501 5077 4749 4507 2838 2556 2459 2140 1986 1700 1159
10 11 12 13 14
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации хлоропластной ДНК с праймерами, комплементарными к последовательности гена ШрБ. Альбиносные растения: 1, 2, 3,11 - БИ 83 (С х Б1); 4, 5, 6,12 - БИ 38 х 1п); 7, 8, 9,13 -БИ 60 (Бк х Кг); 10,14,15,16 - БИ 64 (К х Бк); зеленые растения-регенеранты: 17 - БИ 83 (С1 х Ш); 18 - БИ 38 (Ш х 1п); 19 - БИ 60 (Бк х Кг); 20 - БИ 64 (К: х Бк); растения исходник дигаплоидных линий: 21 - БИ 83 (С1 х ш); 22 - БИ 38 (ш х 1п); 23 - БИ 60 (Бк х Кг). М (маркер) - X, PstI.
тов соответствовал теоретически ожидаемым молекулярным массам исследуемых последовательностей. Вместе с тем шесть из семи генов не выявлялись у ряда альбиносных растений всех исследованных генотипов. При анализе продуктов ПЦР показано, что наиболее часто у дигаплоидных линий не обнаруживался ген, кодирующий Р-субъединицу СРХ комплекса АТФсинтазы, - ШрБ (рис. 1). Продукт амплификации размером 1439 пн не был выявлен в одной повторности из четырех у альбиносных растений дигаплоидных линий БИ 83 (а х и Ш 64 (К: х Бк), у трех из четырех альбиносов Ш 38 (Б1 х 1п) и у всех из Ш 60 (Бк х Кг) (см. рис. 1). В то же время продукт амплификации гена ШрЕ (382 пн) обнаруживался у всех альбиносных растений исследованных дигаплоидных линий.
Изменения генов гЪсЬ, psaA, petA, сетА и ^пЕ происходили с более низкой частотой. Анализ продуктов амплификации свидетельствует о том, что гены гЪсЬ (1410 пн) и petA (831 пн) не выявлялись в одной повторности из четырех у альбиносных растений БИ 83 (С х Б1) - полосы 2 и 1 на рис. 2 соответственно. Ген psaA (2109 пн) не обнаруживался у одного растения БИ 60 (Бк х Кг); cemA (612 пн) - в одной повторности у БИ 64 (К: х Бк) (см. рис. 2); ггпЕ (46 пн) - у одного альбиноса Ш 38 (Б1 х 1п).
Таким образом, проведенные исследования показали, что ПЦР-анализ в основном не выявил у альбиносных растений крупных структурных
изменений иссл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.