БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 487-495
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
АНАЛИЗ КИНЕТИКИ ИНДУКЦИИ ФЛУОР ЕСЦЕНЦИИ
ХЛОРОФИЛЛА С ПОМОЩЬЮ СПЕКТРАЛЬНОЙ МУЛЬТИЭКСПОНЕНЦИАЛЬНОЙ АПП Р ОКСИМАЦИИ
© 2015 г. Т.Ю. Плюснина, С.С. Хрущев, Г.Ю. Ризниченко, А.Б. Рубин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, 1/12 Поступила в р едакцию 02.03.15 г.
П редложен метод анализа экспериментальных данных по кинетике индукции флуоресценции хлорофилла, основанный на получении спектральных характеристик сигнала кинетики индукции флуоресценции с помощью мультиэкспоненциального ряда и дальнейшем анализе частичных сумм полученного ряда. Метод позволяет выделить новые фазы в кинетике сигнала и вместо полуэмпирической оценки стадий, используемой в большинстве исследований, ввести более строгие и универсальные критерии оценки фаз индукционных кривых. Применение предлагаемого метода для анализа индукционных кривых, полученных на клетках водоросли СЫат1йотоиа$ гвтНагАи при серном голодании, показывает его эффективность для обнаружения возникающих неявных фаз индукционной кривой, соответствующих ранним стадиям развития стресса.
Ключевые слова: фотосинтез, кинетика индукции флуоресценции хлорофилла, анализ индукционной кривой, мультиэкспоненциальная аппроксимация.
И сследование первичных реакций фотосинтеза относится к одной из наиболее р азвитых областей биофизики фотобиологических про -цессов. К первичным (световым) процессам фотосинтеза относят последовательность реакций разделения зар ядов и перено са электр онов при действии квантов света. Детально изучены мо-лекуляр ный состав комплексов, участвующих в первичных реакциях переноса электронов, а также механизмы большинства р еакций. Со -гласно современным представлениям, кванты света поглощаются молекулами хлорофилла антенны СЫ (рис. 1а) и безызлучательно пер ено -сятся на пигмент реакционного центра фотосистемы II Рб8о, вызывая разделение зарядов и появление донорно-акцепторной пары Рб8о+РЬе-.
Следующим акцептором электронов в цепи реакций является первичный хинон QA, который принимает один электрон и передает его на молекулу втор ичного хинона (пластохинона) Qв, способного принять два электрона (рис. 1а). Полное восстановление всех молекул перено счиков приводит к появлению так называемых «закрытых» р еакционных центров и обратному потоку электронов. Возвращаясь на пигмент реакционного центра, часть потока энергии электр онов высвечивается в виде флуоресценции, другая часть диссипир ует в тепло.
Одним из важных биофизических методов, позволяющих оценивать эффективность первич-
ных pеакций фотосинтеза, является измерение индукции флуоресценции хлорофилла in vivo. В основе данного метода лежит регистрация изменения интенсивности флуоресценции хлорофилла адаптированных к темноте образцов после включения постоянного возбуждающего света. Интенсивность флуоресценции изменяется от некоего исходного уровня F0 (после тем-новой адаптации растения) до максимального уровня FM (так называемое быстрое нарастание кинетики флуоресценции, ~ 200-400 мс) (рис. 1б) и затем медленно (в течение ~ 1-10 мин) уменьшается до стационарного уровня.
График быстрого нарастания интенсивности флуоресценции, построенный в логарифмическом масштабе по времени, как правило, представляет собой трехфазную кривую, называемую, в соответствии с отображаемыми фазами, OJIP (рис. 1б). X ар актерные времена выделенных фаз соответствуют определенным группам реакций, происходящих на этих вр емена х. Большинство исследователей сходится во мнении, что фаза 0J (0-2 мс) отражает кинетику фотовосстановления QA в активных центрах фотосистемы II и влияние на нее различных тушителей (молекул, за счет которых происходит уменьшение выхода флуоресценции, см. обзор [2]). Кинетика фаз J-I-P (2-30-200 мс) все еще вызывает различные дискуссии [3-6], однако в соответствии с утвердившейся теор ией Дайсенса
Рис. 1. (а) - Схема переноса электронов в цепи переносчиков фотосистемы II (см. пояснения в тексте), (б) -типичная кривая световой индукции флуоресценции. Кривая получена для клеток Ск1аш1^шопаз теткат^и, выращенных в нормальных условиях [1].
и Свирса [7] считается, что восстановление 0А продолжается до тех пор, пока не будет достигнут максимум пр и этом на фо р му кр ивой могут оказывать влияние реакции во сстановле-ния пула пластохинонов, а также во сстановление последующих пер ено счиков в электр он-транспортной цепи и электрохимический потенциал на тилакоидной мембр ане. Максимальный ур овень ^М соответствует максимальному восстановлению 0А. По амплитудам и характер ным вр еменам фаз индукции флуо р есценции можно оценивать эффективность электронного тр анспор та в фото системе II, а также влияние ингибито р ов и мутаций.
Анализ экспериментальных данных по быстр ой стадии индукции флуо р есценции шир око используется исследователями для оценки активности фото синтетического аппар ата и влияния на него внешних факто р ов. Так, в работах [8-10] анализ индукционных кр ивых использовали для изучения устойчивости растений к недостатку влаги и выявления генотипов с повышенной засухоустойчивостью. Автор ы работ [11-14] и сследовали механизмы адаптации к р аз-личным условиям о свещения. В работе [15] оценивали оптимальные условия р о ста лишайников, используемых в качестве биомаркеров при загрязнения окружающей среды при проведении биомонитор инга.
Анализ кинетики индукции флуоресценции хлорофилла долгое время проводили простым визуальным сравнением контрольной кривой с кр ивыми, полученными пр и различных воздействиях. В дальнейшем на о снове теор ии энергетических потоков была предпринята попытка формализации анализа кинетики индукции
флуо р есценции и пр едложен метод расчета ха -р актер истик этих потоков (ЛР-тест, [16,17]) по амплитудам фаз индукционной кр ивой. И споль-зуя значения амплитуд, опр еделяемые в фикси -рованные моменты времени (2 мс для 01 и 30 мс для Л), а также наклон кр ивой в на -чальный момент вр емени, можно р ассчитать р азличные хар актеристики, опр еделяющие эффективно сть пер вичных р еакций пер ено са элек -тр онов. П р едложенный Штр ассер ом метод выделения фаз индукционных кривых является полуэмпир ическим, что существенно огр аничи-вает область его пр именения, поскольку хар актер ные времена индивидуальных фаз индукционной кр ивой не являются фиксир ованными и зависят как от объекта исследования, так и от условий эксперимента.
Попытки уйти от полуэмпир ического опр е-деления фаз индукционной кр ивой были пр ед -п р иняты в работах [18-20], где автор ы и споль-зовали пр едставление кинетики индукции флуо -р есценции в виде суммы двух или т р ех эк спо-нент. С помощью такого разложения были оценены амплитуды и константы скоростей стадий 01, Л и № нар астания индукции флуор есценции хлор офилла.
Теоретическую основу для представления кинетики индукции флуоресценции хлорофилла в виде суммы экспоненциальных функций дают математические модели первичных процессов фото синтеза, пр едставляющие собой системы обыкновенных дифференциальных уравнений, линейных относительно переменных состояний фото системы II [21-25]. П р и постр оении таких моделей используется описание переходов между со стояниями фото системы II реакциями
первого порядка. Из теории дифференциальных уравнений известно, что решением такой системы будет являться сумма экспоненциальных функций. Число компонентов этой суммы будет соответствовать числу элементарных реакций. В работах [26,27] нами было показано, что детальную модель переноса электронов в фотосистеме II, состоящую из большого числа уравнений, можно редуцировать, сгруппировав реакции по характерным временам и используя приближение квазиравновесных состояний. П редложенный подход позволяет объяснить тот факт, что визуально различимыми являются только три фазы индукции флуоресценции, несмотря на большое число последовательных элементарных реакций переноса электрона.
Суммируя вышесказанное, можно видеть, что в современных методах анализа индукционных кривых используется либо полуэмпирическая оценка амплитуд фаз кривой (ЛР-тест), определяемых как значения интенсивности флуоресценции в фиксированные моменты времени, либо представление кривых в виде суммы трех экспонент для оценки характерных времен и амплитуд фаз кривой. Такое представление обусловлено в основном традиционным выделением в кинетике индукции флуоресценции трех фаз, обнаруживаемых визуально в полулогарифмическом по времени масштабе. В то же время современные представления об устройстве и функционировании фотосинтетического аппарата указывают на существование большего числа процессов, чем число фаз, явно обнаруживаемых на индукционных кривых. П редметом настоящей р аботы является р азра -ботка метода выделения процессов, оказывающих существенное влияние на ход кривой индукции флуоресценции, на основе математического анализа индукционной кривой. Нами предлагается подход, позволяющий с помощью спектральной мультиэкспоненциальной аппроксимации найти и охарактеризовать дополнительные фазы кривой индукции флуоресценции. Характерные времена этих фаз могут быть со -поставлены с конкретными процессами переноса электрона в фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Изменение характерных времен и амплитуд этих фаз при изменении условий эксперимента может дать важную информацию о регуляции первичных процессов фотосинтеза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Представление кинетики индукции флуоресценции в виде суммы экспоненциального ряда с фиксированными временами. Как указывалось
выше, различные состояния комплексов фотосистемы II могут быть описаны системой линейных дифференциальных уравнений, решение которой можно представить в виде суммы экспоненциальных функций. Вообще говоря, число экспоненциальных функций определяется количеством уравнений. Параметр времени, входящий в показатель экспоненты, представляет со -четание констант скоростей элементарных реакций [20,26]. Характерные времена переноса электронов в первичных реакциях фотосинтеза могут различаться на пять
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.