РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 556-561
= КЛЕТОЧНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04
АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ОСНОВ ВТОРИЧНОЙ АТРОФИИ ТИМУСА У ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
© 2013 г. А. Н. Митин*, М. М. Литвина, В. В. Комогорова, Н. И. Шарова, А. А. Ярилин|
Институт иммунологии ФМБА России, Москва
Методом проточной цитометрии осуществляли поиск субпопуляций тимоцитов, ответственных за развитие экстренного восстановления и вторичной атрофии тимуса у мышей, подвергнутых сублетальному облучению (4 Гр). Ожидалось, что численность таких клеток должна возрастать в период, непосредственно предшествующий пику экстренного восстановления, и снижаться в ходе процесса вторичной атрофии. Этим критериям в наибольшей степени удовлетворяла фракция тимоцитов стадии на которой осуществляется перестройка большей части генов Т-клеточного рецепто-
ра. Обсуждается возможность коррекции вторичной атрофии с помощью ростового фактора БМ клеток — 1Ь-7.
у-Излучение, двойные отрицательные тимоциты, вторичная атрофия тимуса, проточная цито-метрия.
БОТ: 10.7868/80869803113060088
В 1960-е годы было описано явление вторичной атрофии тимуса после действия ионизирующей радиации в сублетальных дозах [1]. Феномен состоит в том, что после облучения наступает очень быстрое восстановление тимуса, достигающее максимума, близкого к норме, на 10-е сут, после чего происходит повторная атрофия органа, проявляющаяся снижением численности всех видов клеток. Авторы тогда же объяснили это явление тем, что поскольку опустошение лимфоид-ных органов, вызванное радиацией, нарушает иммунную защиту, то организм делает усилие для максимально быстрого устранения дефицита лимфоидных клеток, прежде всего в тимусе, путем размножения клеток-предшественников, находящихся внутри этого органа, чем временно достигается упомянутая цель. Однако реагирующие клетки не обладают способностью к самоподдержанию, вскоре они полностью расходуются, в результате чего численность тимоцитов вновь падает. Это объяснение в целом признается справедливым до сих пор [2], но за 50 лет после открытия явления вторичной атрофии в иммунологии накопилось такое огромное число методов анализа, особенно клеточного, что есть смысл вновь обратиться к этому феномену, чтобы уточнить некоторые его детали и выяснить участие в нем разных типов клеток-предшественников.
Цель данной работы заключалась в идентификации клеток тимуса, с участием которых в наи-
* Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, Каширское ш., 24, корп. 2, ФГБУ "ГНЦ — Институт иммунологии" ФМБА России; тел.: (499) 617-79-19; факс: (499) 61710-27; e-mail: mitin@inbox.ru.
большей степени связано как экстренное восстановление, так и вторичная атрофия тимуса.
В данной работе будет использована номенклатура клеток тимуса, общепринятая в современной научной литературе [2]. Выделяют три стадии развития тимоцитов в зависимости от экспрессии на их поверхности, так называемых ко-рецепторов — молекул CD4 и CD8 (о содержании клеток разного типа в тимусе см. рис. 1).
DNклетки (от "double negative") — двойные отрицательные CD4CD8- клетки, наиболее юная часть клеток тимуса (часто в качестве самых молодых тимоцитов оценивают, как это делали мы в данной работе, CD3CD4CD8-, т.е. тройные отрицательные клетки; при этом во избежание терминологической путаницы сохраняется обозначение "DN клетки").
DP клетки (от "double positive") — двойные положительные CD4+CD8+ клетки, наиболее многочисленные клетки тимуса — корковые тимоциты, не являющиеся зрелыми Т-клетками.
SPклетки (от "singlepositive") — одинарные положительные клетки, которые разделяют на две субпопуляции — CD4+CD8- клетки, впоследствии выполняющие функцию Т-хелперов и ре-гуляторных Т-клеток, и CD8+CD4- клетки, будущие цитотоксические Т-лимфоциты.
Внутри фракции DN клеток, особенно важных в контексте данной статьи, выделяют еще четыре стадии развития клеток по экспрессии маркерных молекул CD44 и CD25. По степени зрелости они располагаются в ряд: DN1 — CD44+CD25-, ранние клетки-предшественники, которые ми-
грируют в тимус из кроветворных органов; DN2 — CD44+CD25+ клетки, находящиеся на стадии подготовки к самому важному событию в диффе-ренцировке Т-лимфоцитов — перестройке генов Т-клеточного рецептора (TCR), которая является условием формирования уникального антиген-специфического рецептора; DN3 — CD44CD25+ клетки — стадия, на которой происходит перестройка трех из четырех генов TCR; DN4 — CD44-CD25- клетки, стадия, на которой завершается перестройка генов TCR, что является условием для последующей экспрессии этого рецептора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили мыши-самки линии C57BL/6 (вес 18—20 г), полученные из питомника РАМН "Столбовая".
Мышей подвергали воздействию у-излучения 137Cs на установке "Стебель" в дозе 4 Гр [3]. Забой мышей и исследование тимуса проводили через 4, 8, 10, 12, 20 и 30 сут после облучения. Контролем служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и мыши, облученные в соответствующие сроки. В каждой точке исследования было использовано по 6 мышей в опытной и контрольной группе, разделенных поровну на два эксперимента.
Тимус извлекали, освобождали от соединительной ткани, суспензировали в PBS с 1%-ным BSA и 0.1%-ным NaN3. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева. Клетки инкубировали с моноклональными антителами в том же буфере в течение 30 мин при 4°С. В случае определения экспрессии ki-67 после постановки поверхностных моноклональных антител клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы "eBioscience" (США) ("Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer") согласно методическим указаниям фирмы. Пер-меабилизация — создание в цитоплазматической мембране микроскопических отверстий для проникновения меченных флурохромами антител внутрь клетки с целью выявления внутриклеточного маркера пролиферации ki-67. После этого клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте с моноклональными антителами к ki-67, снова отмывали и сразу без фиксации анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность исследуемых субпопуляций DN тимоцитов, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт тимоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.
4.62% ' -ЧИ 82.07% ïLiiâfitë^ ЯИгГ
. \! : -fâJÂ ■ . ' ..-.-Y;.. y.. : : 4.04% _:___ "ФЖзеА ■ ■ ДЕ' ■^■Щш-'- 9.28% _' >Л ____
CD4
28.79% ;. : " s * ■ " -'.ï'-Jhfi'i'1. •г .,.. 9.20% .-. . л™? ■ ■ .
.« Л , 1 .« . • ■ ■ , ^ffiSSftШ - V ; 45.07% г .'■ . - *. 1 . _•*., ■ л. »>- ' . ^"V ^ ." ^ » / , 4 *,' ! ; ' ■ " * " ' 1 " " Г" . ■ " . . 16.94%
CD44
Рис. 1. Распределение и содержание фракций тимоцитов при цитометрическом анализе экспрессии молекул CD4, CD8, CD44, CD25 у необлученного животного.
Результаты представлены в виде графиков типа "дот-плот", где по осям отмечена интенсивность свечения флурохрома соответствующего исследуемому маркеру. Сами клетки представлены в виде точек. В углах квадрантов — процент клеток соответстствующих фракций — на верхнем графике — от общего числа тимоцитов, на нижнем — от числа DN тимоцитов.
Использовали моноклональные антитела, меченные различными флуорохромами — FITC (флуоресцеина изотиоцианат), PE (фикоэрит-рин), APC (алофикоцианин), PerCP-Cy5.5 (пери-динин хлорофилл протеин — цианин 5.5), PE-Cy7 (фикоэритрин — цианин 7), Alexa Fluor 647. Использовали следующие комбинации монокло-нальных антител фирмы "eBioscience" (США)
558
МИТИН и др.
Число тимоцитов, млн
250 -
225 - т
200' L А
175
150
125 -\
100 -\ 1 ^v
75 - \ а.
50 - \ /
25
0 4 8 12 16 20
Число DP-клеток, млн 225 200 175 150! 125 100 75 50 25
0 4 8 12 16 20 24 28 32 Сроки после облучения, сут
Сроки после облучения, сут Рис. 2. Динамика суммарной численности тимоцитов (А) и ЭР-клеток (Б) после облучения мышей в дозе 4 Гр.
(препараты для изотипических контролей той же фирмы):
1) Anm-CD3-PE-Cy7 + aHra-CD4-FITC + ан-™-CD8-PerCP-Cy5.5 + анти-СD25-APC + анти-CD44-PE. Анализ осуществляли по следующей схеме. По прямому и боковому светорассеянию выделяли гейт тимоцитов — окно, отделяющее тимоциты от остальных клеток. Среди тимоцитов по экспрессии молекул CD4 и CD8 выделяли основные популяции. Далее фракцию DN клеток анализировали на экспрессию CD44 и CD25 (рис. 1)
2) Anrn-CD3-PE-Cy7 + анти-CD4-FITC + ан-™-CD8-PerCP-Cy5.5 + анти-СD25-PE + анти-ki-67-Alexa Fluor 647. Данное сочетание монокло-нальных антител использовали для оценки пролиферации тимоцитарных фракций по экспрессии внутриклеточного фактора ki-67.
Статистическую обработку данных по численности клеток проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики; результаты выражали в виде M ± SD, где М — средняя арифметическая, SD — стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 2 проиллюстрированы основные проявления вторичной атрофии тимуса после облучения в дозе 4 Гр. На левом графике представлено общее изменение численности тимоцитов, описываемое двугорбой кривой. Правый график отражает численность DP тимоцитов. В точке "0 сутки" представлены средние значения у контрольных мышей по всем точкам наблюдения, при этом к 30-м сут у них не было отмечено значимой инволюции тимуса. Для наглядности динамики изменения числа клеток мы не стали использовать логарифмическую шкалу, поэтому укажем, что на 4-е сут клеточность составила 3.9 млн клеток, а число DP тимоцитов — 0.9 млн. Практически полное совпадение графиков означает, что, термин "вторичная атрофия" отражает
по преимуществу динамику численности ЭР тимоцитов. Динамика SP тимоцитов после облучения в тех же условиях сходна, но кривая менее ре-льефна [3].
Поскольку задачей работы был поиск тех клеток, от изменения которых в наибольшей степени зависит развитие как экстренного восстановления, так и вторичной атрофии, то наибольшее внимание уделено ЭМ клеткам. На рис. 3 предста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.