научная статья по теме АНАЛИЗ КОРТИЗОЛА В ВОЛОСАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕТРОСПЕКТИВЫ СТРЕССА: МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ КОРТИЗОЛА В ВОЛОСАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕТРОСПЕКТИВЫ СТРЕССА: МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 86-88

== МЕТОДЫ

УДК 612.8

АНАЛИЗ КОРТИЗОЛА В ВОЛОСАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕТРОСПЕКТИВЫ СТРЕССА: МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

© 2015 г. М. В. Онуфриев1, 2, *, С. В. Фрейман1, 2, Т. А. Дружкова2, А. Б. Гехт2, Н. В. Гуляева1, 2

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 2Государственное бюджетное учреждение здравоохранения научно-практический центр психоневрологии ДЗМ, Москва

Традиционно для исследования интенсивности стрессогенных воздействий применяется определение уровня стрессорного гормона кортизола в биологических жидкостях человека (крови, реже слюне или моче). Однако различные факторы, влияющие на биосинтез и/или метаболизм кортизола, а также необходимость определения гормона в течение длительного периода осложняют групповые исследования и интерпретацию результатов, полученных на этом биологическом материале. Более того, детекция уровня кортизола на момент забора крови или слюны не отражает суммарную стрессорную нагрузку, которую перенес пациент за предшествующий исследованию период. В последнее время количественное определение кортизола в волосах рассматривают как подход к анализу длительного (месяцы) периода системной стрессорной нагрузки. Адаптирован метод определения кортизола в волосах человека. В основе метода экстракция кортизола из навески волос метанолом, удаление метанола и растворение экстрактивных веществ в фосфатно-солевом буфере с последующим иммуноферментным анализом уровня кортизола. Рассмотрен аналогичный подход к оценке уровня кортикостерона в шерсти грызунов, который может быть полезен для сравнительных/трансляционных исследований.

Ключевые слова: стресс, кортизол, кортикостерон, глюкокортикоиды, гипоталамо-гипофизарно-над-почечниковая ось, волосы.

Б01: 10.7868/81027813315010069

Хорошо известно, что кортизол играет важную роль в реакции организма на стресс, и его концентрация в крови быстро повышается вслед за активацией оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники (ГГНО) в результате действия стрессоген-ного фактора. Тем не менее, наряду с моментальным изменением уровня кортизола, существуют патологические состояния, когда низкий или высокий уровень кортизола держится длительное время (гипо- и гиперкортизолизм) и предопределяет индуцированные стрессом болезни [1—3].

До недавнего времени последствия стресса оценивали, анализируя кортизол в образцах крови, слюны и мочи. Недостатком этих методов является невозможность их использования в лонгитюдных исследованиях, поскольку они применимы для оценки стресса в короткие интервалы времени. Более того, на индивидуальный уровень кортизола могут влиять различные факторы, в том числе цир-кадианные ритмы [4, 5], прием пищи [6] и физические упражнения [7], что делает оценку кортизола в определенный момент неточной. Так, разница в индивидуальных циркадианных ритмах и существенное падение уровня кортизола в утренние ча-

* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а, e-mail: mikeonuf1@rambler.ru.

сы, обычные для отбора крови на анализ в условиях клиники, обусловливают существенный разброс результатов внутри группы.

Анализ такого биологического объекта, как волосы, широко используют для оценки уровня наркотиков и токсических веществ [8]. Поскольку скорость роста волос составляет в среднем 1 см/месяц, оценка уровня наркотиков может отражать длительность применения этих веществ [9]. С недавнего времени в волосах определяют также стресс-гормон кортизол, что рассматривают как возможность ретроспективного анализа системного уровня кортизола за длительный период (месяцы) и как отражение кумулятивной активности ГГНО в клинических и экспериментальных исследованиях [10].

В связи с вышеизложенным, задачей настоящей работы явилась адаптация описанного метода выделения кортизола из волос к последующей оценке его уровня в условиях клинической лаборатории.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы волос были получены от 4-х добровольцев мужского пола в возрасте 22—49 лет.

АНАЛИЗ КОРТИЗОЛА В ВОЛОСАХ ДЛЯ ОЦЕНКИ РЕТРОСПЕКТИВЫ СТРЕССА

87

20

л

§ 15

S «

§ 10

IS &

о

а

□ 5 мг □ 10 мг 0 20 мг

23 года

49 лет

80

г

мг

^ 60

с

о 40

m g

ft

О 20

23 года 25 лет 45 лет

49 лет

Калибровка экстракции кортизола из различных навесок волос (а) и содержание кортизола в волосах добровольцев разного возраста (б). Разные добровольцы обозначены по их возрасту.

0

Ножницами срезали волосы максимально близко к корням в области затылка; вес образцов составлял приблизительно 30—40 мг. Экстракцию кортизола из волос проводили по методу, описанному Yamada и соавт. [11] с небольшими модификациями. Навеску волос 5—20 мг измельчали маленькими хирургическими ножницами, помещали в пробирки Eppendorf на 2 мл с закручивающейся крышкой, добавляли 1 мл метанола и инкубировали 16 ч при 52°C на термо-шейкере (Biosan, Латвия). В дальнейшем, метанольный экстракт был перенесен в другие пробирки, которые высушивали в вакуумном концентраторе (Concentrator plus, Eppendorf, Германия). После испарения метанола в пробирки добавляли 250 мкл фосфатно-солевого буфера (рН 7.4) и растворяли остаток на термо-шейкере 10 мин при 25°C. В связи с тем, что не все экстрактивные вещества растворяются в водном растворе буфера, но могут влиять на последующий иммуноферментный анализ гормона, образцы фильтровали с использованием Eppen-dorf-совместимых бумажных фильтров (размер пор 10 мкм) (Thermo Scientific, США). Данный этап не описан в методической части известных нам исследований, в которых определяли корти-зол в волосах, но необходим для корректного определения гормона. Вышеописанную схему применяли также для экстрации кортикостерона из шерсти крысы линии Вистар до и после умеренного эмоционально-болевого стресса, который осуществляли на каждый пятый день в течение 30 дней (электроболевое раздражение в течение 10 мин).

Кортизол в экстрактах волос определяли с помощью набора Acceess Cortisol (Beckman Coulter, США) для иммуноферментного анализа с конкурентным взаимодействием согласно инструкции к набору. Пробы измеряли на автоматическом им-мунохимическом анализаторе Acceess-2 (Beckman Coulter, США). Кортикостерон в экстрактах шерсти крысы определяли с использованием DRG corticosterone ELISA kit (DRG International Inc.,

США), который также основан на конкурентном взаимодействии, согласно инструкции к набору. Данные представлены в виде средних, которые определял анализатор из нескольких повторов измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как видно из рисунка (часть а), экстракция кортизола линейно повышается с увеличением навески волос от 5 до 20 мг. Несмотря на различный исходный уровень гормона, подобная зависимость наблюдалась у добровольцев в возрасте 23 года и 49 лет. У 4-х добровольцев в возрасте от 23 лет до 49 лет интервал уровня кортизола в волосах составлял от 21.63 пкг/мг до 62.45 пкг/мг (рисунок, часть б), что совпадает по абсолютным значениям с результатами других исследователей, которые применяли иммуноферментный анализ для определения уровня кортизола в волосах [12]. Sauvé и соавт. [12] показали, что на уровень кортизола не влияет окраска волос и область головы, где взят образец волос, однако косметические воздействия, приводящие к гибели волос, снижают уровень гормона. В этом же исследовании выявили отсутствие корреляций между уровнем кортизола в волосах, сыворотке и слюне и наличие незначительной по коэффициенту, но достоверной корреляции между уровнем кортизола в волосах и суточной моче (r = 0.33; P = 0.041).

Как предполагают, кортизол проникает в волосяной стержень из кровотока посредством простой диффузии и связан с пулом свободного, но не общего кортизола [13, 14]. На скорость роста волос и поступление в них кортизола могут влиять различные заболевания (например, гипо- и гипертиреоидизм), возраст, а также локальный синтез или метаболизм в волосяном фолликуле [15, 16].

В шерсти крысы линии Вистар исходный уровень кортикостерона составлял 189.74 пкг/мг, однако после месячного периодического умеренного стресса он повысился до 227.88 пкг/мг. Повыше-

88

ОНУФРИЕВ и др.

ние содержания кортизола в шерсти зарегистрировали у самцов макаки-резус в результате стресса транспортировки [17].

Выявлены положительные корреляции между уровнем кортизола в волосах и хроническим стрессом у беременных женщин [18]. Анализ кор-тизола в волосах был применен к пациентам с психическим заболеванием — биполярным аффективным расстройством, при котором дисрегу-ляция ГГНО может играть этиологическую роль. Уровень кортизола в волосах пациентов, у которых заболевание проявилось после 30 лет, был значительно выше по сравнению с группой здоровых людей [19].

Таким образом, анализ уровня кортизола в волосах является неинвазивным методом и достаточно информативен для лонгитюдных исследований системного изменения уровня стресс-гормона за длительный период (месяцы) у здоровых людей и у больных различными соматическими и психическими патологиями.

Поддержано грантом Российского научного фонда № 14-25-00136.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fries E., Hesse J., Hellhammer J., Hellhammer D. // Psychoneuroendocrinology. 2005. V. 30. P. 1010-1016.

2. Nijm J., Jonasson L. // Ann. Med. 2009. V. 41. P. 224233.

3. Cohen S., Janicki-Deverts D., Miller G. // JAMA. 2007.

V 298. P. 1685-1687.

4. Groschl M., Rauh M, Dorr H. // Clin. Chem. 2003.

V 49. P. 1688-1690.

5. Wietzman E., Fukushim D., Nogeire C., Roffwarg H., Gallaghe T. // J. Clin. Endocrion. Metab. 1971. V. 33. P. 14-22.

6. Gibson E, Checkley S, Papadopoulos A., Poon L., Daley S. // Psychosom. Med. 1999. V. 61. P. 214-224.

7. Galbo H. // Int. J. Sports. Med. 1981. V. 2. P. 203-211.

8. Villain M., Cirimele V., Kintz P. // Clin. Chem. Lab. Med. 2004. V. 42. P. 1265-1272.

9. Wennig R. // Forensic. Sci. Int. 2000. V. 107. P. 5-12.

10. Russell E, Koren G., Rieder M., Van Uum S. // Psychoneuroendocrinology. 2012. V 37. P. 589-601.

11. Yamada J., Stevens B., de Silva N. // Neonatology. 2007. V 92. P. 42-49.

12. Sauvé B., Koren G., Walsh G., Tokmakejian S., Van Uum S.H. // Cl

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Медицина и здравоохранение»