научная статья по теме АНАЛИЗ ЛОКАЛИЗАЦИИ ФИБРИЛЛАРИНА И МЕСТ СИНТЕЗА ПРЕ-РРНК В ЯДРЫШКО-ПОДОБНЫХ ТЕЛЬЦАХ GV ООЦИТОВ МЫШИ ПОСЛЕ УМЕРЕННОЙ ОБРАБОТКИ ПРОТЕИНАЗОЙ К Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ЛОКАЛИЗАЦИИ ФИБРИЛЛАРИНА И МЕСТ СИНТЕЗА ПРЕ-РРНК В ЯДРЫШКО-ПОДОБНЫХ ТЕЛЬЦАХ GV ООЦИТОВ МЫШИ ПОСЛЕ УМЕРЕННОЙ ОБРАБОТКИ ПРОТЕИНАЗОЙ К»

ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 3, с. 162-173

БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

УДК 576.315.45

АНАЛИЗ ЛОКАЛИЗАЦИИ ФИБРИЛЛАРИНА И МЕСТ СИНТЕЗА ПРЕ-рРНК В ЯДРЫШКО-ПОДОБНЫХ ТЕЛЬЦАХ GV ООЦИТОВ МЫШИ ПОСЛЕ УМЕРЕННОЙ ОБРАБОТКИ ПРОТЕИНАЗОЙ К

© 2015 г. К. В. Шишова*, Ю. М. Ходарович*, Е. А. Лаврентьева**, О. В. Зацепина*

*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10 **Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова

119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы МГУ, д. 1, стр. 73 E-mail: zatsepina_olga@mail.ru, kseniya.shishova@inbox.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.

Окончательный вариант получен 12.11.2014 г.

Постнатальное развитие ооцитов млекопитающих сопровождается функциональной и структурной перестройкой ядрышкового аппарата, которая завершается в предовуляторных GV ооцитах появлением крупных (до 10 мкм в диаметре) телец, получивших название ядрышко-подобные тельца (ЯПТ, NLBs — nucleolus-like bodies). Показано, что материал ЯПТ необходим для раннего развития зародышей, однако, его состав до сих пор остается невыясненным. В настоящей работе с использованием белок-связывающего красителя флуоресцеин-5-изотиоцианата (ФИТЦ) мы показали, что обязательным компонентом ЯПТ в GV ооцитах мыши являются белки, характеризующиеся высокой локальной концентрацией. С помощью мягкой обработки ооцитов протеиназой К мы впервые установили, что одним из таких белков является фактор раннего процессинга пре-рРНК белок фиб-рилларин. Фибрилларин присутствует во внутренней массе ЯПТ всех ооцитов, способных к синтезу рРНК, но, в отличие от "поверхностного" фибрилларина, не колокализуется с местами включения БрУТФ, микроинъецирумого в ооциты для выявления транскрибирующихся рибосомных генов. Эти наблюдения косвенно свидетельствуют в пользу накопления внутри ЯПТ ядрышковых белков, не участвующих в биогенезе рибосом. В GV ооцитах NSN-типа все ЯПТ, присутствующие в одном ядре, содержат фибрилларин и связаны с активными рибосомными генами. Результаты, полученные в работе, говорят о том, что обработка GV ооцитов мыши протеиназой К позволяет: (1) выявлять "скрытые" белки внутри плотно уложенного материала ЯПТ, (2) повышает качество изображений ооцитов при выявлении мест синтеза рРНК с помощью БрУТФ, но (3) не выявляет активные рибосомные гены во внутренней массе ЯПТ. Флуоресцентный краситель ФИТЦ может быть рекомендован для локализации внутриклеточных белков в ооцитах всех млекопитающих.

Ключевые слова: ядрышко-подобное тельце (ЯПТ), ФИТЦ (FITC), протеиназа К, фибрилларин, синтез пре-рРНК, БрУТФ, GV ооциты мыши.

DOI: 10.7868/S0475145015030064

ВВЕДЕНИЕ

Созревание ооцитов и фолликулов в яичниках млекопитающих — это сложный и многоступенчатый процесс, который от начала роста ооцита до его овуляции у мыши занимает около трех недель (Gilbert, 2010). Одной из ключевых стадий фолликулогенеза является формирование ан-тральной полости, которое совпадает с окончанием периода большого роста ооцита, частичной инактивацией синтетических процессов в ядре и началом структурной и функциональной перестройки ядрышкового аппарата (Rienzi et al., 2012). Трансформация ядрышка завершается в предовуляторных (или germinal vesicle, GV) ооцитах обра-

зованием структур, получивших название "ядрышко-подобные тельца" (nucleolus-like bodies, NLBs, ЯПТ), или "постъядрышки" (Боголюбов, 2000; Почукалина и Парфенов, 2008). Основными морфологическими признаками ЯПТ, резко отличающими их от ядрышек соматических клеток и преантральных ооцитов, являются крупные размеры (диаметр ЯПТ в GV ооцитах мыши составляет около 10 мкм), правильная округлая форма и высокая оптическая плотность, свидетельствующая о высокой плотности упаковки их материала (Chouinard, 1971). По функциональному состоянию ЯПТ делятся на две основные группы: синтезирующие и не синтезирующие пре-

рРНК. Первый тип характерен для "неокружен-ных" (non-surrounded, NSN-тип) ооцитов, основным признаком ядер которых является наличие хромоцентров, которые контактируют с ЯПТ и располагаются в нуклеоплазме (Debey et al., 1993; Zuccotti et al., 1998, 2005, 2011). В NSN-ооцитах активные рибосомные гены выявлены только на поверхности ЯПТ (Bouniol-Baly et al., 1999). Второй, транскрипционно инертный тип ЯПТ, характерен для более зрелых, или "окруженных", ооцитов (ооциты SN-типа). В SN-ооцитах хромо-центры практически отсутствуют, а ЯПТ окружены слоем конденсированного хроматина (Bouni-ol-Baly et al., 1999; Zuccotti et al., 2005; De La Fuente, 2006; Почукалина и Парфенов, 2008; Bellone et al., 2009). В яичниках гормонально стимулированных самок всегда присутствуют также GV ооциты переходных стадий, что указывает на длительность процесса, связанного с пространственной реорганизацией хроматина (Debey et al., 1993). При культивировании in vitro развитие ооцита NSN-типа в ооцит SN-типа занимает 6—7 суток (Pesty et al., 2007). На светооптическом уровне ооциты NSN- и SN-типов не различаются по размерам или иным морфологическим признакам, поэтому для их идентификации необходимо использовать ДНК-связывающие красители. Методами электронной микроскопии установлено, что ЯПТ ооцитов обоих типов образованы фибриллами диаметром около 4 нм, которые однородно и плотно упакованы в GV ооцитах SN-типа. ЯПТ ооцитов NSN-типа имеют более сложную организацию. На ультратонких срезах в их составе описаны мелкие "сферулы", содержащие рыхло-уложенные фибриллы, вакуоли разного размера, а также небольшие скопления гранул, размером около 15—20 нм (Почукалина и Парфенов, 2008). В ЯПТ обоих типов не выявляются основные структурно-функциональные домены активных ядрышек, включая фибриллярные центры (основные места локализации РНК полимеразы I), плотный фибриллярный компонент (область, где происходит ранний процессинг пре-рРНК) и гранулярный компонент, соответствующий местам сборки рибосомных частиц (Почукалина и Парфенов, 2008).

Однако вопрос о природе материала, образующего ЯПТ, до сих пор остается открытым. Из-за ограниченного числа ооцитов, способных к созреванию, фракцию выделенных ЯПТ для биохимического анализа получить чрезвычайно сложно, а для некоторых видов млекопитающих, включая человека — практически невозможно. Поэтому изучение ЯПТ, как правило, производят с использованием цито- и иммуноцитохимических методов, позволяющих манипулировать с отдельными клетками. Однако использование антител для выяснения состава ЯПТ в GV ооцитах разных видов млекопитающих не позволило убедительно вы-

явить в них какие-либо белки, включая белки ядрышка. Факторы транскрипции рДНК (РНК по-лимераза I, UBF, PAF53) и процессинга рРНК (фибрилларин, NPMl/нуклеофозмин, нуклео-лин, SURF6) разными авторами были описаны только на поверхности ЯПТ и в нуклеоплазме, но не внутри ЯПТ (Zatsepina et al., 2000; Fair et al., 2001; Maddox-Hyttel et al., 2007; Romanova et al., 2006; Почукалина и Парфенов, 2008). Очевидно, что отсутствие сведений о молекулярном составе ЯПТ не позволяет установить их роль в оогенезе млекопитающих.

На необходимость изучения состава ЯПТ указывают также результаты исследований последних лет, которые были выполнены на эмбрионах, полученных из "энуклеолированных" (т.е., лишенных ЯПТ) GV ооцитов. Этими работами доказано, что такие эмбрионы не формируют нормальные пронуклеусы (Ogushi, Saitou, 2010; Inoue et al., 2011), теряют часть центромерной сателлит-ной ДНК (Fulka, Langerova, 2014) и останавливаются в развитии на стадии двух- или четырех бла-стомеров (Fulka et al., 2003; Ogushi et al., 2008).

ЯПТ описаны в GV ооцитах всех изученных на сегодняшний день видов млекопитающих, включая мышь (Chouinard, 1971), крысу (Antoine et al., 1988), свинью (Kopecny et al., 1996), корову (Hyt-tel et al., 2001) и человека (Parfenov, 1989). Это является свидетельством в пользу важности данных образований не только для эмбриогенеза, но и оогенеза млекопитающих.

Цель настоящей работы — анализ локализации и транскрипционной активности ЯПТ в GV ооцитах мыши в обычных условиях и после умеренной обработки ооцитов протеиназой К. В работе предлагается новый цитохимический метод, позволяющий выявлять внутриклеточные белки ооцитов с помощью флуоресцентного красителя флуоресцеин-5-изотиоцианата (ФИТЦ). ФИТЦ — это производное флуоресцеина, которое широко используется для мечения антител и других белков (пептидов) in vitro, а также в проточной цито-флуориметрии соматических и бактериальных клеток (Traganos et al., 1988). В составе белков (пептидов) ФИТЦ ковалентно связывается с а-амино-группами аминокислот (Jullian et al., 2009). Однако ФИТЦ на сегодняшний день не применялся для анализа локализации внутриклеточных белков методами микроскопии. Другой подход, использованный в работе — это иммуноцитохимическое выявление белков ЯПТ после обработки фиксированных ооцитов протеиназой К. В соматических клетках такое воздействие способствует выявлению "скрытых" антигенных детерминант, которые недоступны для связывания антителами в стандартных условиях (D'Amico et al., 2009; Svis-tunova et al., 2012; собственные наблюдения). Перспективность применения такого подхода была изучена нами на примере ключевого яд-

рышкого белка и фактора раннего процессинга рРНК фибрилларина.

Окрашивание GV ооцитов флуоресцентным белок-связывающим красителем ФИТЦ позволило отчетливо выявить белки во внутренней массе ЯПТ ооцитов и показать высокую плотность их упаковки, используя метод конфокальной лазерной микроскопии. Путем умеренной обработки протеиназой К ооцитов, зафиксированных в стандартных условиях, во внутренней массе ЯПТ нами впервые выявлен один из типичных ядрышковых белков — фибрилларин. Однако отсутствие активных рибосомных генов внутри ЯПТ косвенно свидетельствует о его частичной или полной функциональной инертности. Множественные (более одного) ЯПТ, присутствующие в ядре GV ооцита NSN-типа, способны к синтезу пре-рРНК и содержат фибрилларин.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Лабораторные животные

Эксперименты выполняли на самках мышей линии C57B1/6 4—8 недельного возраста. Жив

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»