УДК: 579.22,577.1,57.08.
АНАЛИЗ МЕТАБОЛИТНОГО ПРОФИЛЯ КЛЕТОК Chlamydomonas reinhardtii В УСЛОВИЯХ АВТОТРОФНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
© 2015 г. Р. К. Пузанский*, А. Л. Шаварда***, Е. Р. Тараховская*, М. Ф. Шишова*
*Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет, Санкт-Петербург,199034
e-mail: spbu@spbu.ru **Ресурсный центр "Развитие молекулярных и клеточных технологий", Научный парк СПбГУРоссия, Санкт-Петербург, 199034 Поступила в редакцию 30.06.2014 г.
Проведен анализ метаболитного профиля одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, выращенной в автотрофных условиях, на поздних этапах развития культуры. Для идентификации метоболитов применяли метод газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометри-ей. Выявлено около 400 пиков, соответствующих индивидуальным соединениям, из которых идентифицировали около 100, в том числе сахара, жирные кислоты, ароматические соединения, аминокислоты, спирты и др. С помощью программных продуктов MassBank создана локальная база данных масс-спектров неидентифицированных соединений. Картирование метаболомных данных с помощью сервиса ChlamyCyc показало вовлеченность идентифицированных соединений в энергетические, синтетические и сигнальные пути хламидомонады. Картирование метаболитов на основе их химической структуры с применением программы Cytoscape в сочетании с количественной интерпретацией, показало, что большая часть органического вещества сосредоточена, в первую очередь, в углеродных скелетах жирных кислот и терпенов, а также сахаров и структурно сходных с ними соединений.
DOI: 10.7868/S0555109915010134
Зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii Dangeard имеет большое значение для экологии, так как представляет собой важный компонент разнообразных экосистем. Наряду с этим, она является перспективным объектом биотехнологии, поскольку синтезирует широкий спектр метаболитов: сахара, аминокислоты, ненасыщенные жирные кислоты, каротиноиды, фенольные соединения и др. Многие из этих соединений обладают биологической активностью: противомик-робной, антиоксидантной, противоопухолевой, антивирусной и т.д. [1]. Перспективность биотехнологического использования обусловлена и тем, что C. reinhardtii способна продуцировать водород — потенциальное биотопливо [2]. В связи с этим, расшифровка механизмов регуляции метаболизма хламидомонады как в условиях in vivo, так и in vitro, является одной из актуальных задач.
C. reinhardtii используется как модельный одноклеточный фотосинтезирующий организм в широком спектре физиологических, генетических и биохимических исследований, сфокусированных на изучении процессов фотосинтеза [3], минерального питания [4], адаптации к стрессовым условиям [5], организации цитоскелета [6] и формирования клеточной стенки [7]. Разработаны методы генетической трансформации хламидомонады, созданы информационные ресурсы, содержащие данные о штаммах и протоколы методик, напри-
мер www.Chlamy.org. Завершен проект по секве-нированию генома хламидомонады, что позволяет использовать генетически модифицированные клетки хламидомонады в качестве "фабрик", производящих биологически активные соединения [8].
В последние годы особое значение в физиологических исследованиях приобретает новый методический подход, основанный на максимально полном описании спектра метаболитов объекта и их количественной оценке. Согласно современным представлениям, метаболитный профиль является комплексным результатом активности клетки на молекулярно-генетическом и биохимическом уровнях. Следовательно, данный подход может быть использован в качестве эффективного инструмента не только для характеристики фенотипов [9], но и для выявления адаптационных механизмов к стрессовым факторам [10], оценки онтогенетических [11], диагностики патологических изменений [12] и т.п. Анализ метаболомных спектров позволяет выявить ограниченное число биохимических маркеров биологических процессов, протекающих в организме [13].
На сегодняшний день метаболомные исследования хламидомонады немногочисленны и ограничены лишь анализом метаболических изменений при действии на клетку таких факторов, как минеральное голодание [4], анаэробиоз [14], не-
достаток углекислого газа [15], азотное голодание [16]. Идентификацию метаболитов в этих исследованиях осуществляли на основании данных газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектромет-рией (ГХ-МС) с использованием стандартных протоколов и библиотек хромато-масс-спектрометри-ческих данных, таких как Golm Metabolome Database (GMD), MassBank и NIST/EPA/NIH.
Методика метаболомного анализа включает несколько важных этапов. Первый этап пробо-подготовки заключается в скорейшей остановке метаболизма для минимизации возможного искажения метаболитного профиля. Было показано, что эффективным методом фиксации одноклеточных организмов является смешивание биологического образца с метанолом, охлажденным до температур ниже —40° C [17]. Например, такую фиксацию применяют при исследовании бактерий: Escherichia coli [18]; Klebsiella oxytoca [19], Lactobacillusplantarum [20], а также в метабо-ломных исследованиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae [21] и Pichiapastoris [22]. Подобная методика обеспечивает остановку метаболизма с небольшой утечкой метаболитов. В случае использования данной методики для остановки метаболизма хламидомонады, утечка большинства метаболитов не превышает 10%. Несколько соединений (например, путресцин, миоинозит, галактоза) обладают большими значениями утечки — до 20%. Наибольший уровень утечки был продемонстрирован для пролина — 24.1% [23]. Следующий этап пробоподготовки — экстракция метаболитов. Наиболее простым методом является непосредственная экстракция из суспензионной культуры. Данный способ обладает рядом существенных недостатков. При низкой плотности культуры будут экстрагированы лишь небольшие количества метаболитов. Кроме этого, результаты будут искажены наличием экстраклеточных метаболитов. Методы экстракции метаболитов из осажденной биомассы лишены этих недостатков, но при этом объект подвергается дополнительным манипуляциям. Разнообразие химической структуры соединений, присутствующих в биологических пробах, и физико-химические особенности исследуемого объекта диктуют разнообразие применяемых методов. Библиотеку протоколов для биохимического анализа разных групп соединений в растительных тканях можно найти на сайте PlantMetabolomics.org. Классическими методами являются экстракция хлорной кислотой, горячим метанолом или этанолом, но современные исследования доказывают, что такая процедура приводит к значительной потере метаболитов и отличается нестабильностью результатов [24]. Для достижения максимальной эффективности экстракции в метаболомных исследованиях используют холодные смеси, содержащие метанол, хлороформ и воду. Таким способом обеспечива-
ется наиболее мягкое извлечение метаболитов из растительных тканей, дрожжей [25] и микроводорослей [26]. В случае хламидомонады лучшим соотношением является 5 : 2 : 2 для лиофилизиро-ванных проб [23] и 10 : 3 : 1 для экстракции из сырого осадка [4]. Меньшее количество воды по сравнению со смесями, использующимися для высших растений и лиофилизированных проб, может объясняться тем, что осажденная клеточная масса хламидомонады содержит значительное ее количество. Для гомогенизации проб могут быть использованы как специальные шаровые мельницы [9], так и традиционные ступки с пестиками [4]. Cупернатант, полученный после осаждения гомо-гената, используют для разделения и последующей идентификации метаболитов с помощью газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектромет-рией [27]. Для последующего анализа и для выявления связей метаболитов между собой, а также реконструкции метаболических сетей, широко применяются компьютерные программы анализа и визуализации данных [28].
Цель работы - описание спектра метаболитов клеток C. reinhardtii, культивируемых в автотроф-ных условиях, методами ГХ-М^ картирование и анализ результатов современными методами с привлечением программ визуализации данных.
МЕТОДИКА
Культивирование. Культура хламидомонады Chlamydomonas reinhardtii штамм сс-124 была получена из коллекции кафедры генетики и биотехнологии биологического факультета Cанкт-Петер-бургского государственного университета. Культура поддерживалась в автотрофных условиях на жидкой среде TM (Tris Minimal) без ацетата [29]. Культуры постоянно освещались люминесцентными лампами холодного свечения ("Osram", Россия) с интенсивностью 3000 люкс и перемешивались вручную 1 раз в сутки. Плотность культуры в суспензии определяли подсчетом клеток в камере Горяева. Отбор проб проводили в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста культуры. Количественный анализ проводили по 20 биологическим проворностям.
Подготовка проб для хроматографического анализа.
Фиксация. 10 мл суспензионной культуры клеток C. reinhardtii впрыскивали в 10 мл охлажденной в жидком азоте до температуры близкой к фазовому переходу смеси для фиксации, представляющей собой 70%-ный раствор метанола. Фиксацию проводили в пробирке, помещенной в термокружку, заполненную жидким азотом. Далее клетки осаждали 2 мин центрифугированием при —5°C и 10000 g ("MPW Med. Instruments", Польша). Cупернатант сливали, остатки среды
осторожно удаляли с помощью пипетки. Осадок замораживали в жидком азоте.
Экстракция. Осадок переносили в предварительно охлажденную ступку и растирали в холодной смеси, состоящей из метанола, хлороформа и воды в соотношении 10 : 3 : 1 [4]. При экстракции в пробу добавляли внутренний стандарт — нормальный углеводород трикозан (C23H48). Затем экстракт очищали от остатков клеток центрифугированием с охлаждением при 12000 g 10 мин. Отбирали супернатант и выпаривали на вакуумном испарителе ("Eppendorf", Германия). Далее пробу анализировали сразу или хранили в морозильнике при температуре —30°С.
Силилирование. Сухой остаток растворяли в 40 мкл пиридина. Силилирование проводили, добавляя 40 мкл BSTFA (^0-бис(триметилси-лил)трифторацетамид) с добавлением 1% TMCS (триметилхлорсилана), затем инкубировали 15 мин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.