УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2014, том 134, № 2, с. 133-148
УДК 612.111:612.118.221.3:577.352.38
АНАЛИЗ МЕТОДА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ И МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
© 2014 г. О. Г. Шевченко1, Л. Н. Шишкина2
1Институт биологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва E-mail: microtus69@mail.ru
Проанализировано использование различных вариантов метода индуцированного окислительного гемолиза эритроцитов крови для оценки мембранопротекторных и антиоксидантных свойств биологически активных соединений разной природы. Показана необходимость учета различных факторов (источник эритроцитов крови и их исходный антиоксидантный статус, индуктор окисления, используемый растворитель и его концентрация), способных оказывать влияние на результаты исследований. Обосновано, что для оценки биологической активности соединений наряду с определением степени гемолиза целесообразно комплексное изучение состояния эритроцитов физико-химическими, биохимическими и биофизическими методами, в частности, определение степени окисления оксигемоглобина, интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), анализ морфологической трансформации эритроцитов крови.
Ключевые слова: эритроциты крови, окислительный гемолиз, биологически активные соединения, антиоксидантная активность, мембранопротекторные свойства.
ВВЕДЕНИЕ
Поиск наиболее активных и относительно малотоксичных биологически активных веществ (БАВ) для использования их на практике обусловливает необходимость проведения их первичного отбора на модельных биологических системах. Известно, что биологическая активность большинства соединений зависит от их способности влиять на регуляцию процессов ПОЛ, а также воздействовать на структурное состояние клеточных мембран (Burlakova, 2005). Многолетний опыт исследований природных и синтетических соединений, биологически активных комплексов естественного происхождения и пищевых продуктов свидетельствует о том, что не существует простых и универсальных методов оценки их антиоксидантной (АО) способности даже в системах in vitro (Бурлакова и др., 1975; Huang et al., 2005; Tabart et al., 2009; Niki, 2010; Takebayashi et al., 2010). Для оценки антиоксидантной активности (АОА) индивидуальных веществ, их смесей, растительных экстрактов и биологических образцов используются различные методы: ини-
циированное окисление углеводородов, автоокисление жирных кислот и их эфиров, реакции со стабильными свободными радикалами и органическими кислотами (в частности, с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом - (DPPH) и 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислотой) (ABTS), анализ антиоксидантной активности в эквивалентах тролокса (trolox equivalent antioxidative capacity, TEAC), оценка способности поглощать радикалы кислорода (oxygen radical absorbance capacity, ORAC) или уменьшать концентрацию ионов железа (ferric reducing antioxidant power, FRAP), анализ общей радикал-перехватывающей способности (total oxyradical scavenging capacity, TOSC) и др. (Бурлакова и др., 1975; Рогинский, 1988; Исследование..., 1992; Prior et al., 2005; Thaipong et al., 2006; Niki, 2010). Однако часто корреляция между результатами, полученными разными методами, либо между данными, полученными одним методом в разных лабораториях, отсутствует (Бурлакова и др., 1975; Thaipong et al., 2006; Niki, 2010). Так как и антиоксидантная, и антирадикальная активность существенно зави-
сят от типа модельной системы, то общая АОА (total antioxidant capacity, TAC) пищевых продуктов и биологических жидкостей, измеряемая различными методами, как правило, является полуколичественным тестом и часто не коррелирует со способностью ингибировать окисление (Niki, 2010). Кроме того, АОА различных соединений, определенная в модельных системах, не всегда совпадает с их биологической активностью при введении в организм млекопитающих (Бурлакова и др., 1975; Гендель и др., 1996; Burlakova, 2005; Niki, 2010; Rizvi et al., 2010). Это обусловлено целым рядом факторов: различием ингибирующей эффективности БАВ в гомогенной и гетерогенной среде, возможностью появления синергизма и антагонизма, масштабы которых сильно колеблются в зависимости от соотношения концентраций фос-фолипидов (ФЛ) и природных или синтетических АО, степенью ненасыщенности липидов и физико-химическими характеристиками АО веществ (Бурлакова и др., 1975, 1995; Богуславская и др., 1990; Barclay et al., 1997; Niki, 2010; Mazaletskaya et al., 2010, 2012). Кроме того, на биологическую активность оказывают влияние особенности структуры и липофильность соединений, определяющие их способность встраиваться в мембрану и взаимодействовать с компонентами клетки, а также поведение вещества в желудочно-кишечном тракте, скорость экскреции из организма и его биотрансформация с участием ферментативных систем (Niki, 2010; Rizvi et al., 2010). В этой связи первичная оценка биологической активности индивидуальных соединений или экстрактов требует изучения механизма их воздействия не только в химических, но и в клеточных модельных системах (Hseu et al., 2008).
Удобной клеточной моделью исследования механизмов развития окислительных повреждений являются эритроциты крови - специализированные клетки, лишенные аппарата синтеза белка и липидов, циркулирующие в сосудистом русле при постоянных высоких концентрациях кислорода и содержащие высокие концентрации ионов переходных металлов (Новицкий и др., 2004; Sivonova et al., 2004; Доманский и др., 2005; Шевченко, Шишкина, 2009, 2010). Эритроциты чувствительны к оксидативным повреждениям вследствие значительного содержания полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в липидах мембран и наличия гемоглобина, являющегося потенциальным промотором окислительных процессов (Chiu et al., 1982, 1989; Sadrzadeh et al., 1984; Clemens, Waller, 1987; Berg et al., 1991b, 1992; Scott et al., 1993; Артюхов и др., 1997; Lopez-Revuelta et al.,
2005, 2006; Dai et al., 2006; Magalhâes et al., 2009; Takebayashi et al., 2010).
Цель настоящего обзора - анализ факторов, учет которых требуется при использовании метода окислительного гемолиза эритроцитов для оценки биологической активности природных и синтетических соединений.
НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эритроциты крови используют для оценки токсичности тяжелых металлов (Stuart et al., 1979; Piriou et al., 1987; Casado et al., 2007; Quintanar-Escorza et al., 2007; Li et al., 2008; Baranowska-Bosiacka et al., 2009, 2009; Schiar et al., 2009; Kumar et al., 2010), различных химических соединений и БАВ (Munday et al., 2003; Bukowska, Kowalska, 2004; Koumanov et al., 2005; Rodi et al., 2006; Wang et al., 2006; Bukowska et al., 2007; Stasiuk, Kozubek, 2008; Barreca et al., 2009; Chen, Deuster, 2009; Jiang et al., 2009; Wang et al., 2010), лекарственных средств (Balcerczyk et al., 2004; Щерба-ченко, 2008), пестицидов (Гендель и др., 1984; Narendra et al., 2007), животных ядов (Belokoneva et al., 2003), а также при тестировании новых материалов на гемосовместимость (Henkelman et al., 2009).
Однако наиболее часто на эритроцитах крови осуществляют тестирование АОА веществ и скрининг эффективных мембранопротекторов в условиях окислительного стресса, индуцируемого различными химическими соединениями. Так, окислительный гемолиз эритроцитов крови широко используется для оценки АОА соединений растительного происхождения (Deng et al., 2006; Yang et al., 2006; Ajila, Rao, 2008; Asghar, Masood, 2008; Barreira et al., 2008; Costa et al., 2009; Filipe et al., 2009; Wang et al., 2009; Silva et al., 2011). В частности, был показан антигемолитический эффект метанольных экстрактов плодов (мякоти и кожуры) (Magalhâes et al., 2009) и листьев айвы (Costa et al., 2009), листьев зеленого чая (Costa et al., 2009), экстракта кожуры манго (Ajila, Rao, 2008 ), флавоноидов меда (Blasa et al., 2007), кур-кумина и его аналогов (Deng et al., 2006; Banerjee et al., 2008), водного экстракта олиго сахар ид ов (Wang et al., 2009), полифенолов оливкового масла (Paiva-Martins et al., 2009), растительного препарата силимарин (Kiruthiga et al., 2007), содержащего полифенолы водного экстракта семян пажитника сенного (Kaviarasan et al., 2004), полифенолов, содержащихся в красном вине (Tedesco et al., 2000). На модели индуцированного гемолиза эритроцитов крови был показан АО эффект кар-
нитина (Solarska et al., 2010) и мелатонина (Zhao et al., 2008). В отдельных экспериментах метод пероксидного гемолиза эритроцитов использован и для оценки радиопротекторных свойств соединений (Малакян и др., 2009). В некоторых случаях анализ биологической активности веществ проводится на основании сравнительной устойчивости к гемолизу эритроцитов крови человека или животных, предварительно употреблявших в пищу исследуемые соединения (Bondan et al., 2005; Zhu et al., 2005; Tulipani et al., 2011). Наконец, имеет место сравнительная оценка параметров гемолиза эритроцитов крови здоровых доноров и лиц, подверженных какому-либо заболеванию. В частности, показана повышенная чувствительность к индуцированному гидропероксидом гемолизу эритроцитов пациентов, страдающих диабетом первого типа (Kaviarasan et al., 2004), а также высокая чувствительность к ААРН-индуцированному гемолизу лиц, больных Р-талассемией (Ko et al., 1997).
ИСТОЧНИКИ ЭРИТРОЦИТОВ
Анализ литературы показал, что примерно в 75% исследований используются эритроциты крови человека, как правило, доноров. В подавляющем большинстве случаев в дальнейшем проводится инкубация эритроцитов, отмытых от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием, в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7.4), который представляет собой простейшую систему, моделирующую "физиологические" условия (Krokosz et al., 2008). Значительно реже используются эритроциты, инкубируемые в присутствии плазмы (Soderberg et al., 2009), или непосредственно цельная кровь (Piriou et al., 1987; Niki et al., 1988). В ряде исследований используются эритроциты крови лабораторных животных: кроликов (Tyulina
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.