ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 7, с. 754-758
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 616.9:616-07
АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КРИПТИЧЕСКОЙ ПЛАЗМИДЫ ШТАММОВ Yersinia pestis ИЗ ЦЕНТРАЛЬНО-КАВКАЗСКОГО
ВЫСОКОГОРНОГО ОЧАГА ЧУМЫ
© 2015 г. Е. Г. Оглодин, А. В. Черкасов, Г. А. Ерошенко, Г. Н. Одиноков, Н. Ю. Шавина, Л. А. Новичкова, В. В. Кутырев
Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов 410005
e-mail: rusrapi@microbe.ru Поступила в редакцию 14.07.2014 г.
Проведен анализ последовательности криптической плазмиды размером 5.4 тпн, выявленной в процессе полногеномного сиквенса ДНК штамма средневекового биовара Yersinia pestis, выделенного в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы в Российской Федерации. Определение нуклеотидной последовательности этой криптической плазмиды и ее структурно-функциональный анализ показали, что она содержит 8 открытых рамок считывания, среди которых идентифицированы гены: rep белка репликации, virB6 белка внутренней мембраны системы секреции IV типа, virB5 минорного пилина системы секреции IV типа, а также несколько генов, которые, вероятно, связаны с функциями секреции и транспорта. Анализ общей характеристики ДНК плазмиды pCKF показал, что содержание аденина в ней составляет 28.34%, цитозина 20.5%, гуанина 17.87%, тимина 33.28%, а в целом количество Г + Ц пар равно 38.38%. При этом Г + Ц состав хромосомы штамма Y. pestis С-627 равен 47.6%, что свидетельствует о получении плазмиды pCKF от микроорганизма, филогенетически удаленного как от бактерий рода Yersinia, так и других бактерий семейства Enterobacte-riaceae. Проведено сравнение аминокислотных последовательностей гипотетических белков, кодируемых плазмидой pCKF, с аналогами, обнаруженными у других бактерий. Рассматривается возможное значение плазмиды pCKF в поддержании самой древней из известных филогенетических линий 2.MED0 Y. pestis средневекового биовара, сохранившейся в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы.
DOI: 10.7868/S0016675815060120
Возбудитель чумы Yersinia pestis вызывает особо опасную инфекционную болезнь и циркулирует в природе на грызунах и их блохах. Штаммы Yersinia pestis содержат, как правило, три плазмиды — pCad, pFra и pPst, каждая из которых играет важную роль на разных стадиях патогенеза возбудителя чумы [1]. Две из трех плазмид — pFra (92.6 тпн) и pPst (9.6 тпн) являются видоспецифическими. Плазмида pFra (синоним pMT1) кодирует два связанных с вирулентностью фактора — капсуль-ный белок F1, который позволяет возбудителю избежать фагоцитоза иммунной системой хозяина, и мышиный токсин Ymt, необходимый для трансмиссии Y. pestis с помощью блох. Плазмида pPst (синонимы pPla, pPCP1) кодирует активатор плазминогена Pla, обязательный для развития бубонной и легочной чумы. Плазмида pCad (синонимы pYV, pCD, 70.2 тпн) является общей для трех видов патогенных иерсиний: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Она содержит кластер генов кальцийзависимости (зависимость роста при низких температурах от присутствия в среде ионов Ca+2), ответственный за секрецию факторов вирулентности через аппарат системы секреции III типа в клетки хозяина.
Кроме этих трех типичных для возбудителя плазмид в штаммах Y. pestis могут содержаться дополнительные плазмиды различного размера. Некоторые из них представляют собой рекомби-нанты типичных плазмид возбудителя чумы, а некоторые являются новыми плазмидами, присутствующими у отдельных популяций Y. pestis [2—4]. Плазмида размером около 19.5 тпн — димер 9.5 тпн плазмиды pPst — обнаружена у штаммов Y. pestis, выделенных на западе США [3]. Крипти-ческая плазмида pYC размером 6 тпн выявлена у штаммов Y. pestis, изолированных в провинции Юньнань в Китае [4]. Плазмида pYC содержит 12 открытых рамок считывания, из которых ORF1 идентифицирована как ген белка инициации репликации, а ORF11 и ORF12 как гены, продукты которых DinJ1 и DinJ2, возможно, участвуют в поддержании стабильности ДНК. На участке плазмиды, расположенном перед ORF1, присутствует несколько копий прямых повторов, которые по своим характеристикам схожи с точкой начала (origin) репликации ДНК [4].
В штаммах Y. pestis из Тувинского горного очага чумы в России присутствует плазмида c неиз-
АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
755
вестными функциями размером около 33 тпн [5]. В геноме секвенированного штамма Y. pestis 91001, относящегося к штаммам microtus из двух очагов чумы в Китае, обнаружена критическая плазмида pCRY размером около 22 тпн [6]. Состав Г + Ц пар у нее равен 49.1%, что немного отличает ее от трех других плазмид возбудителя чумы. Последовательность pCRY содержит около 30 генов, к которым относятся: ген repA белка репликации, ген pаrA (разделение и передача реплицирован-ных плазмид в дочерние клетки), а также кластер генов vir системы секреции IV типа (СС4Т). СС4Т является важным фактором вирулентности, который используется бактериальными патогенами для секреции эффекторных белков в клетки хозяина или для передачи плазмид с генами антибио-тикорезистентности. У Agrobacterium tumifaciens СС4Т обычно включает 12 Vir белков: Vir1—Vir11 и белок VirD4, хотя у других бактерий она может содержать дополнительные компоненты или, наоборот, ограниченный набор гомологов этих белков [7, 8]. Структура аппарата секреции IV типа отличается от такового системы секреции III типа как по последовательности составляющих их компонентов, так и по их архитектуре. СС4Т, по-видимому, участвует в секреции широкого спектра веществ, включая большие ДНК-белковые комплексы [8]. Таким образом, Song et al. [6] впервые показали наличие генов СС4Т у штаммов Y. pestis, однако в составе кластера vir в плаз-миде pCRY отсутствовали гены virB7и virB8, ввиду чего функция этого неполного кластера генов СС4Т осталась неясной. Анализ распространения плазмиды pCRY у 257 штаммов Y. pestis из Китая методом ПЦР с праймерами на ген repA выявил положительный сигнал только у 11 штаммов и, следовательно, эта плазмида является атипичной для Y. pestis [6].
На территории Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы в России выделяются штаммы Y. pestis средневекового биовара, которые значительно отличаются от других штаммов этого биовара, широко распространенных в других очагах России, стран СНГ и сопредельных стран. Штаммы отличаются сниженной вирулентностью, наличием уникальной зависимости от аминокислоты пролина и присутствием дополнительной плазмиды размером около 5.4 тпн [9, 10]. Проведенное нами недавно полногеномное се-квенирование пролинзависимого штамма Y. pestis С-627 из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы показало, что эти штаммы являются наиболее древними из всех известных штаммов средневекового биовара [11]. Их древность подтверждает широко распространенное ранее и оспариваемое в последнее время мнение о том, что вторая пандемия чумы "Черная смерть", поразившая Европу в XIII—XIV в. и вызванная
штаммами Y. pestis средневекового биовара, началась именно в регионе Кавказа и Прикаспия.
Целью этой работы было определение полной нуклеотидной последовательности 5.4-тпн плазмиды штаммов Y. pestis из Центрально-Кавказского очага чумы и ее структурно-функциональный анализ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм, условия культивирования, выделение и секвенирование ДНК. Штамм Y. pestis C-627 выделен на территории Кубано-Малкинского района Центрально-Кавказского природного очага чумы от блох Citellophilus tesquorum горного суслика Cit-ellus musticus в 1986 г. Штамм получен из Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ "Микроб", где он хранился в лио-фильно высушенном состоянии. Культивирование штамма проводили в бульоне и на агаре LB (pH 7.2) при 28°С в течение 24—48 ч. Выделение ДНК штамма проводили с помощью "Набора для выделения бактериальной и геномной ДНК AxyPrep Bacterial Genomic Miniprep Kit". Подготовку библиотек размером 200 пн с применением Ion Xpress Library Kit осуществляли в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование генома штамма проводили с помощью системы Ion PGM (Life technologies, США) и автоматического генетического анализатора ABI 3500xl Genetic Analyzer (Life technologies, США). На концевые участки контигов плазмиды были рассчитаны праймеры для замыкания pCKF в кольцо. Полученные с их помощью концевые последовательности контигов использованы для финализации сборки плазмиды.
Компьютерный анализ и программы. Исходные данные секвенирования обрабатывали с помощью пакета программ Ion Torrent Suite software v. 3.4.2. Далее единичные чтения (риды) собирались de novo в контиги программным обеспечением Newbler gsAssembler v. 2.6. При анализе использовали контиги, содержащие не менее 100 единичных прочтений, кратность покрытия каждого нуклеотида составила около 2000 раз. Финализа-цию полной последовательности плазмиды проводили с помощью программного обеспечения UGENE v. 1.12.2.
Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды осуществляли с применением сервера RAST, а аминокислотных последовательностей кодирующих участков — с помощью алгоритма Psi-BLAST на основе данных баз PATRIC, NCBI GenBank, RAST, Uniprot, Pfam и EMBL.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами на основе секвенирования последовательности полного генома штамма Y. pestis
756
ОГЛОДИН и др.
CDS8
ORIGIN
CDS2
CDS7
CDS3
CDS6
CDS5
Карта плазмиды pCKF из штамма Y. pestis С-627 из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. Стрелками отмечены открытые рамки считывания, определенные с помощью сервера RAST и алгоритма NCBI и GenBank glimmer3. Белым треугольником указана предполагаемая точка начала репликации плазмиды.
С-627, выделенного в Центрально-Кавказском высокогорном очаге чумы, было установлено, что он относится к древней линии средневекового биовара (обозначенной нами 2.MED0), не описанной в отечественных и зарубежных публикациях и не представленной в схеме мирового генетического разнообразия [11]. В последовательности штамма С-627 наряду с хромосомной ДНК и пгазмидами pFra, pPst, pCad содержится последовательность криптической плазмиды размером 5.4 тпн. Поскольку эта плазмида не им
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.