БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 8, с. 1079 - 1090
УДК 577.112.855
АНАЛИЗ ПОДВИЖНОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА ЯДРЫШКА ФИБРИЛЛАРИНА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ HeLa*
© 2010 г. В.В. Барыгина12, В.П. Вейко3, О.В. Зацепина1**
1 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)335-7103, электронная почта: zatsepina_olga@mail.ru
2 Биологический факультет Московского государственного
университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-0126, электронная почта: v.barygina@mail.ru
3 ФГУПГосНИИгенетика, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1; факс: (495)315-0501, электронная почта: vveiko@yahoo.com
Поступила в редакцию 04.02.10 После доработки 29.03.10
Белок фибрилларин — это эволюционно-консервативный и обязательный компонент ядрышек клеток эу-кариот, участвующий в процессинге и метилировании пре-рРНК. В молекуле фибрилларина позвоночных содержатся два остатка цистеина (Cys99 и Cys268), сульфгидрильные группы которых могут образовывать внутримолекулярные —S-S-мостики. Однако функциональное состояние фибрилларина с восстановленными и окисленными тиоловыми группами практически не изучено. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о существовании -S-S-формы фибрилларина в клетках человека. Для решения этих вопросов в своем исследовании мы использовали плазмиды, кодирующие нативный фибрилларин человека и его мутант-ную форму, лишенную остатков цистеинов (фибрилларинС99/268S), слитые с EGFP для временной транс-фекции клеток HeLa. Долю мобильной фракции, указывающую на содержание энзиматически активных молекул белка, и время полувосстановления флуоресценции, характеризующее скорость энзиматических реакций, определяли методом FRAP с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Измерения проводили при температурах 37° и 27°. Полученные результаты показали, что пул фибрилларина в клетках HeLa включает две формы: с восстановленными SH-группами и окисленными SH-группами, образующими внутримолекулярные —S-S-мостики между Cys99 и Cys268. Однако отсутствие Cys99 и Cys268 не влияет на локализацию фибрилларина в клетках и его основные динамические свойства. Форма фибрилларина человека без дисульфидных мостиков входит в состав мобильной фракции белка и соответствует его функционально активному состоянию.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фибрилларин, Cys99, Cys268, сайт-специфический мутагенез, FRAP, подвижность белка, клетки HeLa.
Белок фибрилларин относится к эволюци-онно консервативным и жизненно необходимым белкам ядрышка: фибрилларин человека на 94,2% гомологичен фибрилларину мыши, на 82,9% — фибрилларину амфибий и на 74% — фибрилларину пекарских дрожжей, Мор1р [1]. Гомологи фибрилларина присутствуют также у высших растений, гриба Ркуяагитро1уеврка1ит и архебактерий [2, 3]. Фибрилларин необходим для жизнеспособности про- и эукариотических клеток [4, 5] и является обязательным компо-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 10-028, 27.06.2010.
** Адресат для корреспонденции.
нентом малых ядрышковых РНП (мякРНП) С/Б типа из, и8, и13 и и16 [6-8].
В молекуле фибрилларина человека (321 аминокислотных остатка (а.о.), р1 9,5) выделяют три структурных домена (рис. 1) [1]. ^-концевая часть молекулы (8-77 а.о.) образована ОЛЯ-доменом, богатым остатками глицина и аргинина. ОЛЯ-домен содержит сигнальную последовательность, обеспечивающую миграцию фибрил-ларина в ядрышки, он метилирован по остаткам аргинина и отвечает за взаимодействие с другими белками, включая факторы процессинга рРНК. В центральной части (133-222 а.о.) располагается РНК-связывающий домен, характерный для многих белков, взаимодействующих с РНК, и также необходимый для локализации
фибрилларина в ядрышках. В С-концевой области фибрилларина располагается короткий а-спиральный домен (274—306 а.о.). Между доменами находятся два спейсерных участка, роль которых изучена также недостаточно. С помощью конструкций, кодирующих мутантные формы фибрилларина, слитые с БОБР, показано, что отсутствие первого спейсера не препятствует миграции фибрилларина в ядрышки, что косвенно свидетельствует против его функционального значения. Второй спейсер, по-видимому, отвечает за локализацию фибрилларина в местах процессинга пре-рРНК, топологически связанных с фокусами транскрипции рДНК [9, 10].
Анализ кристаллической структуры фибрилларина архебактерии МеЛапососст ]аппа$ски показал, что последовательность его С-конце-вого участка аналогична каталитическому домену многих 8-аденозил-Ь-метионин (АёоМе1:)-зависимых метилтрансфераз [11—13]. У пекарских дрожжей мутация гена белка Иор1 (МОР1) полностью блокировала метилирование рибозы в составе рРНК [4]. Эти наблюдения позволяют заключить, что и у остальных организмов фиб-рилларин является сайт-специфической 2'-О-метилтрансферазой, катализирующей перенос метильной группы на различные нуклеофиль-ные субстраты, основным из которых является ядрышковая рРНК. Полагают, что в фибрилла-рине человека метилтрансферазный домен включает РНК-связывающий домен, второй спейсер и а-спиральный домен [11] (рис. 1). Другая известная функция фибрилларина — участие в процессинге первичных транскриптов рРНК, которая была убедительно показана на дрожжевых мутантах. Мутации гена Иор1 нарушали нормальное созревание рРНК и, в первую очередь, процессинг 5'-внешнего транскрибируемого спейсера [4]. Нок-даун гена фибрилла-
рина в соматических клетках высших эукариот до настоящего времени не производили. Не разработаны также подходы для оценки функционального состояния фибрилларина in vitro.
Особенностью первичной структуры фиб-рилларина всех позвоночных является наличие двух остатков цистеинов (Cys), положение которых строго фиксировано. Так, Cys99 и Cys268, присутствующие в фибрилларине человека, совпадают по положению с цистеиновыми остатками в фибрилларине мыши, крысы и шпорцевой лягушки. У человека Cys99 входит в состав первого спейсера, а Cys268 — в состав второго спейсера и, соответственно, метилтрансферазного домена (рис. 1). Анализ электрофоретической подвижности фибрилларина человека, транслированного in vitro, в отсутствие редуцирующего агента 2-меркаптоэтанола показал, что он мигрирует в виде дуплета, соответствующего двум формам — с восстановленными SH-группами остатков цис-теина (~34 кДа) и замкнутой внутримолекулярной -S-S-связью (~32 кДа) [1]. Аналогичные результаты были также получены при изучении подвижности фибрилларина ядерной фракции гепатоцитов крысы и суммарных клеточных ли-затов макрофагов мыши [14]. Однако функциональное состояние двух форм фибрилларина до сих пор не было изучено, а их наличие в клетках человека не проанализировано. У мыши форма фибрилларина с восстановленными тиоловыми группами является доминирующей [14].
Вопрос о существовании внутримолекулярных взаимодействий между —SH-группами остатков цистеинов в фибрилларине млекопитающих имеет принципиальное значение не только для понимания их роли в функционировании белка, но и для выяснения механизмов повышенной чувствительности фибрилларина к ионам тяжелых металлов и особенно ртути [15].
1 mkpgfspjrgg gfggrggfgd rggrggrggf" gggrgrgggf rgrgrggggg ggggggggrgi 6 1 igggf hsggnr grgrggktrgn qsgknvmvep hrhegvficr gkedalvtkn lvpgesvyge 121 krvsisegdd kieyrawnpf rsklaaailg gvdqihikpg akvlylgaas gttvshvsdii
181 jvgpdglvyav efshrsgrdl inlakkrtni ipviedarhp hkjyrmliamv dvifadvaqp 241 dqtrivalna htflrngghf visikancid sta|saeavfa_ sevkkmqqen _mkpqegltlei
Рис. 1. Аминокислотная последовательность фибрилларина человека. В молекуле выделяют три структурных домена: глицин-аргинин богатый домен (GAR-домен) (8—77 а.о.), РНК-связывающий домен (133—222 а.о.) и а-спиральный домен (274—306 а.о.). Домены разделены первым и вторым спейсерами, содержащими Cys99 и Cys268 соответственно. Метил-трансферазный домен, предположительно, включает РНК-связывающий домен, второй спейсер и а-спиральный домен
Высказано предположение, что связывание Hg(II) с тиоловыми группами стабилизирует внутримолекулярные дисульфидные связи, что приводит к изменению трехмерной структуры фибрилларина, способствует его расщеплению протеасомами и индуцирует образование крип-тических антигенов, запускающих аутоиммунные реакции [15—17]. Известно также, что сульфгидрильные группы входят в состав активных центров многих ферментов, а их блокирование приводит к снижению или исключению каталитической активности энзимов [18—20]. Поскольку фибрилларин является метилтранс-феразой, а его предполагаемый метилтрансфе-разный домен содержит Cys268 (рис. 1), логично предположить, что отсутствие цистеиновых остатков может отразиться на основных свойствах белка в живых клетках.
Основным подходом к анализу белков, включая фибрилларин, in vivo является экспрессия их генов, слитых с генами маркерных флуоресцентных белков, например, EGFP [21, 22]. В сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией и методом FRAP (fluorescence recovery after photobleaching, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) этот подход позволяет изучать локализацию и динамические свойства интересующего белка в живых клетках [23, 24]. Высказано предположение, что мобильная (подвижная) фракция фиб-рилларина образована белком, выполняющем энзиматическую функцию, а немобильная (неподвижная или малоподвижная) фракция фибрилларина соответствует белку, играющему структурную роль [9]. Однако экспериментальные проверки этого предположения не предпринимались. Методом FRAP показано, что фибрилларин относится к одним из наиболее подвижных ядерных белков [9, 25, 26].
В настоящей работе мы оценили значение Cys99 и Cys268 для специфической локализации фибрилларина человека в клетках HeLa и в его динамических свойствах, включающих долю мобильной фракции белка и время полувосстановления флуоресценции. Для этого использовали плазмиды, кодирующие нативный фибрилларин человека и его мутантную форму, в которой с помощью сайт-специфического мутагенеза оба цистеиновых остатка были за
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.