ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № б, с. 631-635
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 577.216.32
АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВНУТРЕННИХ ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРОВ ITS1, ITS2 И РИБОСОМНОГО ГЕНА 5.8S ВИДОВ РОДА Amaranthus
© 2014 г. М. А. Слугина*, К. Торрес Миньо**, М. А. Филюшин***
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1 **Российский университет дружбы народов, 117198Москва, ул. Миклухо-Маклая, 4 ***Центр "Биоинженерия"РАН, 117312Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1
E-mail: mashinmail@mail.ru Поступила в редакцию 12.05.2014 г.
Проведен анализ последовательности ITS1—5.8S—ITS2 у 11 образцов шести видов амаранта (Amaranthus caudatus, A. cruentus, A. hybridus, A. tricolor, A. paniculatus, A. hypohondriacus). Показано, что вариабельность последовательности межгенных спейсеров ITS1, ITS2 и гена 5.8S рРНК анализируемых видов амаранта крайне низка. Впервые определена вероятная вторичная структура молекулы 5.8S рРНК, идентифицированы три консервативных мотива. Выявленная единичная нуклеотидная замена у A. hybridus не изменяла топологию петель. У образца Celosia cristata, взятого в качестве внешней группы, выявлена 4-нуклеотидная инсерция в 5'-конце гена, а также однонуклеотидная делеция в четвертой шпильке, не оказывающая влияния на общую топологию молекулы 5.8S рРНК.
DOI: 10.7868/S0002332914060113
Род Amaranthus L. (сем. Amaranthaceae) включает в себя 60—70 видов культивируемых и дикорастущих растений, родина которых — Южная и Центральная Америка. Амарант представляет особый интерес, так как характеризуется огромным потенциалом пищевой и кормовой культуры. Уникальность амаранта состоит в необычайно высокой питательной ценности всех частей растения. Амарант отличается повышенным по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами содержанием белка (17—19%), крайне сбалансированного по аминокислотному составу и включающего в себя, в частности, незаменимые аминокислоты, а также большой продуктивностью биомассы (Mlakar et al, 2010). Результаты сследований, проведенных в последние десятилетия, свидетельствуют о больших возможностях применения амаранта для лечения и профилактики различных заболеваний (Baskar et al., 2012; Adewale, Olorunju, 2013).
Виды амаранта используются как зерновые, овощные, кормовые, масличные и декоративные культуры. Ряд видов — сорные растения. В качестве зерновой культуры возделываются три вида амаранта: A. caudatus, A. cruentus и A. hypochondria-cus, которые считаются одними из первых доме-стицированных растений Нового Света (Lanoue et al., 1996). Существует гипотеза, согласно которой вид A. hybridus считается прародителем этих трех злаковых видов амаранта (Sauer, 1950). Основным овощным видом амаранта считают А. tri-
color. Отмечено, что виды амаранта благодаря крайне высоким адаптационным свойствам приспособлены к произрастанию в различных эколого-географических зонах, в том числе практически на всей территории России, что делает амарант крайне перспективной сельскохозяйственной культурой. В настоящее время как за рубежем, так и в России активно развивается селекция новых сортов амаранта различного назначения (Hricová et al., 2011).
Известно, что для представителей рода Amaranthus характерна крайне высокая морфологическая вариабельность между видами и даже внутри одного вида (Mosyakin, Robertson, 1996). Наличие подобного полиморфизма, а также способность к образованию межвидовых гибридов не позволяют однозначно определить число видов и их границы, поэтому род Amaranthus считается "сложным" (Costea et al., 2006). Результаты немногочисленных молекулярных и биохимических исследований видов амаранта часто различались, а иногда были противоречивыми (Xu, Sun, 2001; Limanskiï, 2012). Таким образом сегодня имеется достаточно ограниченная и неоднозначная информация о межвидовой и внутривидовой вариабельности генома амаранта.
В настоящее время для оценки межвидовой и внутривидовой изменчивости у представителей многих родов растений используется область ри-босомного оперона ITS1—5.8S—ITS2. Последовательности внутренних транскрибируемых спей-
Таблица 1. Длина спейсеров ITS1, ITS2 и гена 5.8S рРНК у исследуемых образцов
Вид Сорт ITS1, п.н. 5.8S, п. н. ITS2, п. н.
Amaranthus caudatus Алегрия 249 162 218
То же Булава 249 162 218
» ЕСШ7020 249 162 218
» Зеленая сосулька 249 162 218
A. cruentus Дюймовочка 249 162 218
A. hybrídus Неженка 248 162 218
A. hypohondríacus Дон Педро 249 162 218
То же Кизлярец 249 162 218
» Крепыш 249 162 218
A. paniculatus Факел 249 162 218
A. trícolor Валентина 249 162 218
Celosía crístata Вера 233 165 210
серов генов рРНК считаются достаточно эффективными для установления таксономического состава многих семейств и родов, уточнения филогенетических связей и видовой идентификации образцов, а также позволяют оценить полиморфизм относительно недавно разделившихся таксонов (Baldwin et al., 1995; Liston et al., 1996; Alvarez, 2003).
Цель работы — анализ вариабельности последовательности ITS1—5.8S— ITS2 и определение вторичной структуры молекулы 5.8S рРНК у шести видов амаранта из коллекции Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК), представленных сортами отечественной селекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Было отобрано 11 сортов шести видов рода Amaranthus (табл. 1). В качестве внешней группы был выбран образец, относящийся к роду Celosía, который представляет сестринскую группу для Amaranthus (Müller, Borsch, 2005). ДНК выделяли из тканей 15-суточных проростков отобранных образцов согласно модифицированному протоколу с дополнительной депротеинизацией смесью фенол/хлороформ (Слугина и др., 2013). Для амплификации последовательности ITS1—5.8S— ITS2 были использованы праймеры ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC), ITS 5 (GGAAG-TAAAAGTCGTAACAAG) (White, 1990). Нуклео-тидные последовательности секвенировали с помощью системы Bigdye (Applied Biosystems, США) на ABI PRISM 310 (Центр "Биоинженерия" РАН). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы MEGA 5.0. Вероятная вторичная структура молекулы 5.8S рРНК была построена с помощью программы mFold (http://mfold.rit.albany.edu/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Были секвенированы и проанализированы последовательности ITS1—5.8S— ITS2 11 образцов Amaranthus и одного образца родственного рода Celosía. Длины амплифициованных фрагментов представителей рода Amaranthus варьировали от 628 до 629 п. н., последовательность изучаемого фрагмента у представителя рода Celosía составила 606 п. н.
Межвидовой полиморфизм представителей рода Amaranthus. Все изучаемые последовательно -сти видов амаранта характеризовались крайне низким полиморфизмом. Общая вариабельность анализируемого фрагмента составила 2.15%.
Длина последовательностей ITS1 всех видов, за исключением A. hybrídus, была одинаковой (249 п. н.). Длина последовательности A. hybrídus (сорт Неженка) составила 248 п. н., что было следствием однонуклеотидной делеции. Спейсер ITS1 более вариабелен, чем ITS2. В составе ITS1 было выявлено восемь нуклеотидных замен, полиморфизм составил 3.2%. Отметим, что из восьми выявленных SNPs семь были детектированы в последовательности ITS1 вида A. hybrídus. Среди остальных анализируемых представителей рода Amaranthus была выявлена единственная нуклео-тидная замена G/C в положении 43 последовательности ITS1 сорта Зеленая сосулька, принадлежащего к виду A. caudatus, в то время как у других сортов этого вида замена не была обнаружена (табл. 2).
Последовательность межгенного спейсера ITS2 была инвариантна по длине у всех образцов Amaranthus и составила 218 п. н., ее вариабельность составила 2.7% за счет наличия шести SNPs. При этом, как и в случае ITS1, все нуклеотидные замены были характерны только для последовательности вида A. hybrídus. Среди детектированных замен было равное число транзиций (3) и трансверсий (3).
Таблица 2. Характеристика нуклеотидных последовательностей ITS1, гена 5.8S и ITS2 представителей рода Amaranthus
Фрагмент Число вариабельных сайтов Вариабельность, % GC-состав, %
ITS1 8 3.17 59
5.8S 1 0.6 54.3
ITS2 6 2.7 62.9
Как и ожидалось, наиболее консервативной в составе исследуемого фрагмента была последовательность гена 5.8S. Длина гена 5.8S рРНК у всех проанализированных представителей рода Amaranthus составила 162 п. н. У подавляющего большинства видов амаранта на всем протяжении гена замен выявлено не было. Однако, как и в случае ITS1 и ITS2, последовательность вида A. hybridus несколько отличалась от остальных: в ее составе была выявлена транзиция C/T в положении 132 от начала гена. Таким образом, полиморфизм последовательностей гена 5.8S рРНК Amaranthus составил 0.6%.
Отметим, что вариабельность полученных нуклеотидных фрагментов ITS1—5.8S—ITS2 анализируемых образцов крайне низка, что может свидетельствовать о высокой консервативности генома у видов Amaranthus. Некоторым исключением может быть вид A. hybridus, общий полиморфизм спейсерных последовательностей которого по отношению к другим видам рода Amaranthus достигает 2%. Полученные результаты, обнаруживающие низкую вариабельность внутренних транскрибируемых спейсеров, совпадают с биохимическими данными изоферментного анализа, где также отмечен крайне низкий полиморфизм анализируемых белков (Jain, Hauptli, 1980; Юдина и др., 2008). Ранее уже был выявлен низкий полиморфизм некоторых последовательностей у видов амаранта, однако данные, полученные c использованием систем мультилокусного анализа AFLP, SSR и RAPD, свидетельствуют об удивительно высоком (85—97%) геномном полиморфизме (Xu, Sun, 2001; LimanskiT, 2012). Морфоло-
гически виды амаранта очень разнообразны, но при этом характеризуются сходством геномов. Кроме того, многие виды свободно скрещиваются. Постоянно происходящая межвидовая гибридизация приводит к размыванию границ между видами (Trueco etal., 2009).
Сравнительный анализ полиморфизма последовательностей ITS1—5.8S—ITS2родов Amaranthus и Celosía. Интересно было определить степень ди-вергентности последовательностей спесеров ITS и гена 5.8S рРНК рода Amaranthus и сес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.