УДК 579.222.2:54.022
АНАЛИЗ ПУТЕЙ ДЕГРАДАЦИИ ФУНКЦИОНАЛИЗОВАННЫХ АРЕНОВ В УСЛОВИЯХ ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ МОДЕЛЬНЫХ СРЕД
© 2014 г. А. С. Лебедев, В. Ю. Орлов
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова, 150057, Ярославль
e-mail: logos2012@yandex.ru Поступила в редакцию 16.09.2013 г.
Показано, что деградация функционализованных аренов под воздействием смешанной культуры хемоорганоаэрогетеротрофных микроорганизмов проходит преимущественно по пути окислительной интрадиольной дециклизации ароматического кольца. Методом квантово-химического моделирования рассчитаны характеристики пространственной структуры каталитического центра нит-радиолдиоксигеназы, а также комплексов каталитического центра с пирокатехином и протокатехо-вой кислотой. Впервые выявлены зависимости полной энергии фермент-субстратных комплексов от длины связи железо-гидроксильная группа (Fe-4-OH и Fe-1-OH) субстратов до и после отделения воды и аминокислотного остатка тирозина (Тир) от каталитического центра.
DOI: 10.7868/S0555109914040230
Одной из главных проблем химии окружающей среды является изучение путей и механизмов биодеградации ароматических соединений, в числе которых много широко распространенных ксенобиотиков. Одну из ключевых функций в процессе катализа выполняют железосодержащие негемовые диоксигеназы — ферменты, обеспечивающие протекание реакций окислительного разрыва ароматического кольца с участием молекулярного кислорода в качестве окислителя [1—5]. Окислительный разрыв бензольного кольца — один из заключительных этапов деградации карбоароматических соединений. Основными метаболитами являются пирокатехин и протокатеховая кислота [1—8], которые образуются в ходе предварительного этапа гид-роксилирования исходных ароматических веществ.
Выделяют два основных пути окислительного разрыва цикла: экстрадиольный и интрадиоль-ный (рис. 1). В случае экстрадиольного пути разрыв бензольного кольца пирокатехина происходит между атомами С2 и С3 с образованием полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты, протокатехо-вой кислоты, между атомами С4 и С5 до полуальдегида 2-гидрокси-4-карбоксимуконовой кислоты. В случае интрадиольной дециклизации разрыв связи у пирокатехина происходит между атомами С1 и С2 с образованием цис,цис-муконовой кислоты, у протокатеховой кислоты между атомами С3 и С4 с образованием 3-карбокси цис,цис-муко-новой кислоты [6, 9].
В настоящее время активно ведутся работы по выяснению пространственной структуры каталитических центров негемовых диоксигеназ [2—13], а также их комплексов с субстратом, изучаются
отдельные стадии процесса дециклизации: способ активации фермент-субстратного комплекса молекулярным кислородом, присоединение активированного кислорода к субстрату [3, 4]. Стадии взаимодействия субстрата с каталитическим центром фермента исследуются недостаточно. Неясным остается ряд вопросов о пространственных характеристиках каталитического центра и его комплексов с субстратами, а также момент отделения Тир2 и воды от простетической группы каталитического центра.
Изучение процессов окислительной децикли-зации ароматического кольца представляет интерес как в теоретическом, так и в прикладном аспектах, в осбенности для прогнозирования сроков естественного очищения почв и водоемов, селекции штаммов микроорганизмов для биоре-медиации, дизайне и создании химических структур, ускоряющих деградацию ароматических соединений в природных средах.
Цель работы — изучение ключевых путей деградации бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гид-роксибензойной, ацетилсалициловой, прото-катеховой кислот, пирокатехина, метил-, этил- и пропил- парабенов в условиях лабораторного эксперимента, а также выявление структурных особенностей интермедиатов окислительного разрыва цикла пирокатехина и протокатеховой кислоты методами квантово-химического моделирования.
МЕТОДИКА
Реактивы и оборудование. В работе использовали ацетонитрил ос. ч. (НПК "Криохром", Россия), этилацетат х. ч. ("Экос-1", Россия), таурин
Рис. 1. Схемы окислительного разрыва цикла протокатеховой кислоты (1, 3) и пирокатехина (2, 4) для экстрадиоль-ного (1, 2) и интрадиольного (3, 4) путей деградации.
("Вектон", Россия), ацетамид ("Вектон", Россия), 4-хлор-1,2-диоксибензол ("Вектон", Россия), азид натрия 99% ("Panreac", Испания), N-триметил-силилимидазол ("Лабтех", Россия), нитрофуран-тоин ("Ratiopharm GmbH", Германия), глюкозу ("Вектон", Россия).
Анализ методом ВЭЖХ образующихся метаболитов и определение концентрации исходных субстратов проводили в хроматографической системе UltiMate-3000 фирмы "Dionex" (Германия), укомплектованной вакуумным дегазатором, градиентным насосом с возможностью смешивания до трех компонентов элюента, автоматическим пробоотборником с диапазоном ввода образца от 0.1 до 100 мкл, термостатом колонок, спектрофо-тометрическим детектором, позволяющим регистрировать аналитические сигналы на четырех длинах волн одновременно, и хроматографиче-ской рабочей станцией Chromeleon 6.80. Анализ образующихся метаболитов методом ГХ-МС проводили с помощью системы "Agilent" (США) GC 7890A c автосамплером (7693) и масс-селектив-ным детектором (5975С). Особо чистую воду (для хроматографии) получали на установке Simplicity UV ("Merck Millipore", Германия). УФ-спектры субстратов снимали на спектрофотометре UNICO 2802PC ("Юнико-СИС", Россия), pH водного компонента подвижной фазы контролировали на потенциометре И-160М ("Антех", Белоруссия). Модельные образцы термостатировали в термостате MIR-254 ("Sanyo", Япония).
Приготовление модельных растворов. В качестве субстратов деградации выступали следующие функционализованные арены (ароматические соединения, содержащие в структуре карбоксильные, гидроксильные, сложноэфирные функциональные группы): бензойная кислота ("Вектон", Россия), 2-гидроксибензойная кислота ("Вектон", Россия), 4-гидроксибензойная кислота ("Вектон", Россия), ацетилсалициловая кислота ("Вектон", Россия), протокатеховая кислота ("Акрус", Россия), пирокатехин ("Вектон", Россия), метиловый,
этиловый и пропиловый эфиры 4-гидроксибензой-ной кислоты ("Акрус", Россия).
Анализ качественного состава метаболитов функционализованных аренов проводили в эксперименте. Для этого готовили модельный раствор, содержащий 100 мг/л одного из субстратов (для каждого субстрата готовился свой модельный раствор), 1000 мг/л таурина, суспензию хе-моорганоаэрогетеротрофных микроорганизмов (СХМ) в фосфатном буфере. В мерную колбу емкостью 250 мл количественно переносили 0.025 г субстрата, 0.250 г таурина, 20 мкл СХМ, объем доводили до метки фосфатным буферным раствором (0.025 М Na2HPO4; 0.025 М KH2PO4; pH ~6.86). Для приготовления СХМ в 100 мл стерильного мясного бульона бактериологической петлей вносили культуры Pseudomonas putida, Pseudomonas аeruginosa, Rhodococcus opacus. Использование смешанной культуры подразумевало получение различных по составу метаболитов, тем не менее в ходе работы было показано, что основными метаболитами был узкий круг соединений. Мясной бульон с внесенными культурами помещали в термостат при 25°C на 7 сут без доступа света.
Накопительную культуру бактерий-деструкторов получали, используя образцы воды устья реки Дунайка. Накопительные культуры использовали для выделения бактерий. Подтверждение видовой принадлежности выращенных культур проводилась общепринятыми методами: определение окраски по Граму, тесты на цитохромоксидазу и ка-талазу, определение морфологических признаков колоний и клеток, определение наличия пиоциа-нина (визуальное), а также с помощью тест-систем MID-64 и MID-65 ("Microgen Bioproducts", Великобритания).
В качестве питательной среды для P. putida использовали среду с глюкозой в качестве единственного источника углерода и нитрофурантои-ном как ингибитором посторонней микрофлоры [14], для P. аeruginosa — агаризованную среду с
мин
Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограммы модельных растворов бензойной (а) и 4-гидроксибензойной (б) кислот после экспозиции в течение 10 сут: 1 — пирокатехин, 2 — протокатеховая кислота, 3 — 4-гидроксибензойная кислота.
ацетамидом, для R. opacus — минеральную среду с добавлением 4-хлор-1,2-диоксибензола в качестве единственного источника углерода. В качестве контроля использовали среду такого же состава с внесением 0.125 г азида натрия в качестве ингибитора микробного роста. Для роста культуры СХМ и протекания реакций деградации модельные образцы, содержащие исследуемые субстраты, инкубировали в термостате при 25°C без доступа света.
Анализ модельных сред. Анализ метаболитов, образующихся в ходе деструкции ФА, проводили методами ВЭЖХ и ГХ-МС. В ходе ВЭЖХ анализа применяли следующие условия: элюент — ацето-нитрил (5—20%): вода (80—95%), изократический режим, концентрация ацетонитрила подбиралась, исходя из сорбционных характеристик исследуемых субстратов и метаболитов; предколонка — (10 х х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 5 мкм, 120 А); колонка — (150 х 2.1 мм) Acclaim 120 (С18-фаза, 3 мкм, 120 А); расход подвижной фазы — 0.2 мл/мин; температура термостата колонок — 30.0°С; вводимый объем — 20 мкл; детектирование — абсорбция при X = 210, 230 и 254 (одновременное измерение на трех каналах).
ГХ-МС анализ осуществляли в следующих условиях: газ-носитель — гелий ос. ч; скорость подачи газа-носителя — 2 мл/мин; колонка — HP-5MS (5%-фенил-95%-метилполисилоксан; неполярная), внутренний диаметр — 0.25 мм, длина — 30 м, толщина пленки неподвижной фазы — 0.25 мкм; объем ввода образца — 1 мкл, деление потока — 1 : 100; температурный режим: испаритель — 250°С; термостат - 100°С (3 мин), 100-150°С, 10°С/мин; 150°С 2 мин; 150-280°С 10°С/мин; 280°С 14 мин; температура ионного источника — 200°С; детектирование масс-селективное, способ
ионизации — электронный удар, энергия ионизации — 70 эВ, задержка ионизации — 3 мин.
Из модельного раствора метаболиты экстрагировали этилацетатом, упаривали под вакуумом. Далее полученный осадок силилировали N-триме-тилсилилимидазолом при 60°C в течение 30 мин, получая летучие производные экстрагируемых соединений.
Перед непосредственным проведением анализа модельных сред их разводили десятик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.