научная статья по теме АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ ДИАЗОТРОФОВ В ОСАДКАХ СОЛЕНЫХ И СОДОВЫХ ОЗЕР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНА NIFH В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ ДИАЗОТРОФОВ В ОСАДКАХ СОЛЕНЫХ И СОДОВЫХ ОЗЕР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНА NIFH В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 5, с. 583-598

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 579.811.25

АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ ДИАЗОТРОФОВ В ОСАДКАХ СОЛЕНЫХ И СОДОВЫХ ОЗЕР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНА nifH В КАЧЕСТВЕ

МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА

© 2014 г. Т. П. Турова1, 2, Н. В. Слободова3, Б. К. Бумажкин3, М. В. Сухачева3, Д. Ю. Сорокин1, 4

1 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва 2Кафедра микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова 3Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 4 Department of Biotechnology, TU Delft, Delft, The Netherlands Поступила в редакцию 05.11.2013 г.

Был проведен филогенетический анализ генов nifH, кодирующих Fe-белок нитрогеназного ферментного комплекса, у выделенных в чистые культуры аноксигенных фототрофных бактерий различного происхождения, а также у гетеротрофных алкалофильных сульфатредукторов, выделенных из соленых и содовых озер. Топология построенного "нитрогеназного" дерева в значительной степени коррелировала с "рибосомным", что позволило успешно использовать ген nifH в качестве молекулярного маркера для изучения сообществ диазотрофных бактерий в пробах иловых осадков соленых и содовых озер. Хотя диазотрофы были выявлены во всех исследуемых природных образцах, их филогенетическое разнообразие было сравнительно невелико. Наиболее широко представленными в исследуемых образцах оказались сульфатвосстанавливающие дельтапротеобактерии и фото- и хе-мотрофные гаммапротеобактерии. При сравнении диазотрофных сообществ интегральных проб и проб поверхностных слоев иловых осадков в последних было выявлено преобладание фототрофных диазотрофов различных филумов, включая пурпурных серных и несерных протеобактерий, зеленых несерных бактерий, гелиобактерий и цианобактерий. Некоторые обнаруженные филотипы остались неидентифицированными, что свидетельствует о возможном присутствии в осадках групп бактерий, которые пока не удалось исследовать традиционными микробиологическими методами.

Ключевые слова: соленые и содовые озера, азотфиксация (АФ), диазотрофы, ген nifH.

DOI: 10.7868/S0026365614040168

Прокариоты, способные фиксировать молекулярный азот (диазотрофы), присутствуют практически во всех экосистемах, где они выполняют важную функцию снабжения связанным азотом. Однако до сих пор недостаточно исследована их роль в биогеохимическом цикле азота в экстремальных местообитаниях, в частности во внутри-континентальных гиперсоленых озерах. Установлено, что в соленых озерах за процесс азотфикса-ции (АФ) отвечают свободноживущие умеренно галофильные цианобактерии и анаэробные бактерии, азотфиксирующая активность которых подавляется кислородом и светом [1]. При исследовании разнообразия диазотрофов в цианобак-териальных матах соленых озер было показано, что состав их сообщества меняется в зависимости от сезонных изменений степени солености [2].

1 Автор для корреспонденции (e-mail: tptour@rambler.ru).

Содовые озера являются особой формой соленых озер, характеризующихся преобладанием карбонатов/бикарбонатов натрия, что обусловливает стабильно высокий уровень рН (9.0—11.0) в подобных экосистемах. В результате создаются уникальные двойные экстремальные условия солености и щелочности, препятствующие жизнедеятельности эукариот, поэтому в них преобладают натронофильные прокариотные сообщества. Недавние интенсивные исследования прокари-отных сообществ содовых озер выявили основных участников биогеохимических циклов углерода, азота и серы, представленных в чистых культурах исключительно галоалкалофильными видами, составляющими прокариотную структурно-функциональную систему [3—5]. Согласно этой системе потенциальная возможность АФ предполагается для микроорганизмов, представляющих два типа метаболизма: фотоавтотрофный через галоалкалофильных аэробных оксигенных

цианобактерий и аноксигенных пурпурных и зеленых несерных бактерий (зеленые серные бактерии филума Chlorobi пока в содовых озерах не обнаружены) и гетеротрофный через галоалкало-фильных первичных и вторичных анаэробов (Firmicutes, спирохеты, Deltaproteobacteria, мета-ногенные археи). Однако экспериментальные доказательства функционирования диазотрофов в содовых озерах единичны. В частности, прямыми методами (N15) активность АФ была показана для литоральных зон содовых озер Калифорнии и Невады в США и отнесена на счет жизнедеятельности галоалкалофильных цианобактерий, способных к активной АФ при рН 10 и солености до 100 г/л. [6, 7]. Несмотря на очевидное присутствие натронофильных цианобактерий в содовых озерах, их роль в азотном цикле и распространенность среди них способности к диазотрофии остается практически не изученной. Что касается гетеротрофного блока, недавние измерения потенциальной активности АФ в содовых солончаках и анаэробных осадках содовых озер Кулундинской степи (Алтайский край) показали наличие активной диазотрофной популяции натронофильных аэротолерантных бродильщиков, принадлежащих к новым таксонам фирмикут [8—10].

Ключевой для процесса фиксации молекулярного азота ферментный комплекс нитрогеназы состоит из двух субъединиц: FeMo-белка, кодируемого генами nifD и nfK, и Fe-белка, кодируемого геном nifH, который наиболее часто используется в качестве молекулярного маркера при исследовании как известных диазотрофов, так и потенциально способных к АФ прокариот. Ценность данных маркеров состоит в том, что гены нитрогеназы весьма консервативны и их филогения в большинстве случаев совпадает с филогенией гена 168-рРНК. В последние годы у ряда га-лоалкалофильных изолятов из осадков содовых озер, таких как Clostridium alkalicellum [11], Geoal-kalibacter ferrihydriticus [12], Thioalkalispira mi-croaerophila и Alkalilimnicola halodurans [13] была обнаружена способность к АФ и/или функциональный ген нитрогеназы nifH в геноме, однако детальных исследований диазотрофии у представителей этих новых таксонов не проводилось.

Исследования по молекулярной экологии соленых и содовых озер с использованием в качестве маркеров ключевых функциональных генов различных типов метаболизма включали изучение разнообразия автотрофов [14—17] сероокис-ляющих бактерий [18], сульфат-восстанавливаю-щих бактерий [19] и метаногенов [20]. Молекулярный анализ генов nifH был проведен в единственном пока исследовании проб из разных слоев водной толщи содового озера Моно Лэйк в Калифорнии [21]. Эта работа показала преобладание клонов, принадлежащих сульфатредукто-рам из Deltaproteobacteria в анаэробной части и

Gammaproteobacteria в аэробной части водной толщи. Однако измерения активности АФ в водной толще дали отрицательные результаты. Это возможно свидетельствует о том, что, несмотря на высокое разнообразие, бактерии-носители ди-азотрофного потенциала водной толщи озера Моно Лэйк находились в неактивном состоянии.

В настоящей работе гены nifH были использованы в качестве молекулярных маркеров для оценки разнообразия диазотрофных прокариот в поверхностных и интегральных пробах осадков содовых и соленых озер. Кроме того, с целью расширения базы данных была проведена детекция генов nifH, определение их последовательностей и проведение их филогенетического анализа в сравнении с аналогичным анализом генов 16S рРНК у некоторых коллекционных штаммов фо-тотрофных пурпурных бактерий различного происхождения, а также у группы штаммов, принадлежащих к новым родам дельтапротеобактерий-сульфатредукторов, выделенных из содовых озер.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись штаммы пурпурных фототрофных микроорганизмов различного происхождения из коллекции кафедры микробиологии МГУ и недавно выделенный из содового озера пурпурный фототрофный штамм B8-1, идентифицированный согласно анализу генов 16S рРНК как представитель вида Thiorhodospira sibirica [17], а также группа штаммов, принадлежащих к недавно описанным таксонам дельтапротеобакте-рий-натронофильных сульфатредукторов из содовых озер из коллекции ИНМИ (табл. 1).

Кроме того, были исследованы интегральные пробы и пробы поверхностных слоев иловых осадков гиперсоленых хлоридно-сульфатных и содовых озер Кулундинской степи Алтайского края и щелочных гиперсоленых озер Вади Натрун (Ливийская пустыня, Египет) (табл. 2). Осадки из небольших содовых озер были объединены с учетом приблизительно одинаковых значений рН. При этом в смесях преобладали осадки из умеренно-соленых озер. Собранные образцы хранились до использования при 4°C.

Выделение ДНК. Для выделения ДНК из чистых культур использовали набор реактивов Mo-Bio (Ultra Clean Microbial DNA Isolation kit; "MoBio Laboratories"). Процедура выделения проводилась в соответствии с рекомендациями производителя.

ДНК из осадков содовых озер выделяли с помощью набора для выделения тотальной ДНК из почв (MoBio Power Soil DNA Isolation kit; "MoBio Laboratories"). Для получения ДНК брали примерно 10 г осадка и отмывали в 1 M NaCl. Для осаждения песка и крупных иловых частиц полученную суспензию осадков центрифугировали при

Таблица 1. Исследуемые штаммы диазотрофных микроорганизмов (чистые культуры)

Порядок Вид Штамм Длина секвени-рованного фрагмента гена nifH (пн) Коллекция/ Источник выделения

Гамма-протеобактерии

Chromatiales Thiorhodospira sibirica B8-1 393 ИНМИ РАН/содовое оз. Зун-Торей (Забайкальский край)

Thiocapsa sp. 1R 399 Каф. микробиологии, МГУ

Альфа-протеобактерии

Rhizobiales Rhodoblastus acidophilus 5-6 447 Каф. микробиологии, МГУ

Rhodoplanes elegans AS130T 408

Rhodoplanes roseus 941T 381

Rhodomicrobium vannielii К-1 408

Rhodobacterales Rhodovulum sufidophillum Rp-6 447

Rhodovulum eurihalinum DSM 4868Т 390

Rhodovulum adriaticum DSM 2781Т 447

Бета-протеобактерии

Burkholderiales Rubrivivax gelatinosus DSM 149 447 Каф. микробиологии, МГУ

Дельта-протеобактерии

Desulfovibrionales Desufonatronovibrio halophilus HTR 9 399 ИНМИ РАН/гиперсоленые озера (Кулундинская степь)

HTR 10 426

Desulfonatronum thioautotrophicum ASO4-1T 414 ИНМИ РАН/содовые озера (Кулундинская степь)

Desulfonatronum thiosulfatophilum ASO4-2T 402

Desulfobacterales Desulfobotulus alkaliphilus

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком