ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 3, с. 298-305
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 616.9:579.24
АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВАРИАНТОВ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ИЗ ОЧАГОВ МОНГОЛИИ
© 2015 г. Л. М. Куклева, Н. Ю. Шавина, Г. Н. Одиноков, Е. Г. Оглодин, Н. Ю. Носов, Н. А. Виноградова, Н. П. Гусева, Г. А. Ерошенко, В. В. Кутырев
Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов 410005
e-mail: rusrapi@microbe.ru Поступила в редакцию 30.04.2014 г.
Проведено исследование генетического разнообразия штаммов Yersinia pestis из природных очагов чумы в Монголии. Всего исследовано 32 штамма, выделенных в западных, восточных, центральных аймаках и в районе Гоби в Монголии. 24 исследованных штамма относились к основному, а 8 — к неосновным подвидам Y. pestis. Среди штаммов основного подвида только один штамм принадлежал к средневековому биовару (геновариант 2.MED1), а остальные — к античному биовару. Штаммы античного биовара разделились на три группы. Штаммы из восточной части страны относились к ге-новарианту 2.ANT3, из западной и центральной части — к геноварианту 3.ANT2, эндемичному для Монголии. Один штамм из Баян-Улегейского аймака имел редкий геновариант 4.ANT. Ни один из штаммов античного биовара не принадлежал к древней ветви этого биовара 0.ANT, что противоречит распространенному мнению о том, что древняя "сурчиная" раса возбудителя чумы возникла на территории Монголии. Шесть из восьми штаммов неосновных подвидов относились к улегейскому подвиду, эндемичному для Монголии, один штамм — к группе microtus и еще один — к ранее не описанной разновидности неосновных подвидов.
DOI: 10.7868/S0016675815010063
Природные очаги чумы расположены на территории многих государств, включая Российскую Федерацию и другие страны СНГ — Казахстан, Таджикистан, Киргизию, Узбекистан, Туркмению, Армению, а также сопредельные с Россией государства — Грузию, Монголию, Китай [1]. В то время как штаммы Yersinia pestis, циркулирующие в России, других странах СНГ и в Китае, достаточно хорошо изучены по их фенотипическим и генетических особенностям, штаммы Y. pestis из Монголии исследованы значительно меньше. Однако на территории Монголии многие очаги чумы находятся в действующем состоянии, что наряду с активными экономическими и культурными связями между Россией и Монголией создает реальную угрозу заноса этой особо опасной инфекции в нашу страну. Имеется прецедент такого заноса, произошедшего в 2012 г., когда на территорию Алтайского горного очага был занесен вирулентный штамм Y. pestis [2]. Ввиду такой опасности необходимо иметь четкое представление о свойствах штаммов возбудителя чумы из Монголии с тем, чтобы вовремя идентифицировать их, определить источник и возможные пути заноса инфекции. Исследование штаммов Y. pestis из Монголии имеет и несомненный теоретический интерес, поскольку в соответствии с классическими представлениями о происхождении возбудителя чумы наиболее вирулентная "сурчиная" раса Y. pestis возникла именно в Монголии.
По отечественной классификации штаммы возбудителя чумы включают основной (высоковирулентные и эпидемически опасные штаммы) и неосновные (избирательно вирулентные штаммы с низкой эпидемической значимостью) — кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский подвиды [3, 4]. По зарубежной классификации штаммы основного подвида делят на три биовара — античный, средневековый и восточный, а штаммы неосновных подвидов объединяют под общим названием пестоиды, или "Ре81о1ёе8". Штаммы У. pestis всех подвидов и биоваров основного подвида отличаются по биохимической активности. Штаммы основного подвида в отличие от всех неосновных подвидов не ферментируют рамнозу и мелибиозу. Штаммы средневекового биовара не редуцируют нитраты, восточного не ферментируют глицерин, а античного — активны по обоим признакам. Штаммы алтайского, гиссарского и улегейского подвидов также не редуцируют нитраты, а штаммы первых двух также не ферментируют арабинозу.
Проведенное в последнее время секвенирова-ние ряда геномов штаммов У. pestis выявило значительно большее внутривидовое разнообразие возбудителя чумы, чем считалось ранее. В пределах подвидов и биоваров выделяют филогенетические линии и относящиеся к ним геновариан-ты, которые представляют отдельные популяции
возбудителя, существующие в различных ланд-шафтно-географических зонах. Так, штаммы античного биовара относятся к трем филогенетическим линиям: 0.ЛМТ, 1.ЛМТ и 2.ЛМТ. Штаммы древней линии 0.ЛМТ выделяются в высокогорных очагах Тянь-Шаня и Китая, 1.ЛМТ в Африке и 2.ЛМТ в Центральной Азии. На территории Евразии широко распространены штаммы линии 2.МЕЭ средневекового биовара, которые также встречаются в Африке [5—7]. В то же время распределение штаммов различных подвидов, био-варов и геновариантов в природных очагах Монголии остается малоисследованным. Получение этих знаний может пролить свет на возможные пути формирования современных границ ареала возбудителя чумы в процессе формирования вида У. pestis и расширить представление о глобальном генетическом разнообразии У. pestis.
Цель нашей работы — получение генетической характеристики штаммов У. pestis, циркулирующих в различных районах Монголии, и определение геновариантов этих штаммов для установления их места в общей схеме внутривидовой эволюции возбудителя чумы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы, условия культивирования. Использованные в работе штаммы У. pestis, изолированные на территории Монголии в разные периоды времени, представлены в таблице. Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ "Микроб". Их культивирование проводили в бульоне и на агаре LB (рН 7.1-7.2) при 28°С в течение 24-48 ч.
Исследование культурально-морфологиче-ских и биохимических свойств штаммов осуществляли в соответствии с практическим руководством "Лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней" [8].
Способность к ферментации углеводов и спиртов. Ферментативную активность в отношении рамнозы, мелибиозы, арабинозы и глицерина изучали на средах Гисса, содержащих 1% этих субстратов и 1% индикатора Андреде. Культуру штамма выращивали в течение 24 ч при температуре 28°С на пластинках агара LB (рН 7.2). Готовили бактериальную суспензию с концентрацией 1 х 109 м.к./мл, и 0.1 мл засевали в пробирки с 5 мл среды Гисса. Пробирки с посевами инкубировали при температуре 28°С. О наличии ферментации судили по изменению цвета индикатора.
Определение денитрифицирующей активности. Способность к редукции нитратов изучали, выращивая бактериальные культуры в бульоне LB (рН 7.2) с добавлением 0.1% КМ03. Готовили взвесь клеток испытуемого штамма (концентрация 5 х 108 КОЕ), выращенного в течение 18 ч при температуре 28°С. Бактериальную взвесь в объеме 0.2 мл вносили в 4 мл бульона с КМ03 и инкубировали в течение 72 ч при 28°С, затем добавляли 0.5 мл реактива Грисса. Появление окрашивания среды (от розового до темно-красного) свидетельствовало о наличии у исследуемой культуры денитрифицирующей активности.
ПЦР анализ и определение нуклеотидной последовательности. Для выявления в мультилокусной ПЦР штаммов У. pestis основного и неосновных подвидов использовали праймеры следующего состава:
89-S AATCAAATCTCGCCCAGC/89-As GCTGCGTATCATTTCACC, 45-S AGTGGTCTGCTTCTCTGG/45-As CGGCATACACAGAATACC, inv839 TACCTGCACTCCCACAAC/inv1007 CCCATACGCTGATCTACC;
при следующем температурном режиме: 1 цикл 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 с, 55°С 1 мин, 72°С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Полученные в ПЦР продукты анализировали методом электрофореза в 2%-ном агароз-ном геле при напряжении 10—15 В/см.
Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе Genetic Analyzer "CEQ 8000" (Beckman Coulter). Сравнительный анализ геномов бактерий выполняли с использованием нуклеотидных последовательностей штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, с применением алгоритма BLAST и программ DNA STAR v. 11.2.1.25 и Vector NTI Advance v. 11.5.
VNTR анализ. Для определения филогенетического родства штаммов Y. pestis проводили их анализ по семи локусам вариабельных тандемных повторов — yp0120ms01, yp1290ms04, yp2769ms06, yp2916ms07, yp1335ms46, yp4280ms62, yp1580ms70. Для получения амплификатов использовали ранее предложенные праймеры [9]. Полученные с помощью стандартной ПЦР образцы секвенировали на генетическом анализаторе модели "CEQ 8000" (Beckman Coulter). Данные анализировали с помощью ресурсов компьютерной базы данных "The microorganism Tandem Repeats Database" http://minisatellites.u-psud.fr. Построение MLVA7 дендрограммы проводили с помощью алгоритма Ward программы BioNumerics 7.1 (Applied Maths, Belgium).
Использованные в работе штаммы У. реяия из Монголии и их комплексная характеристика
Ферментация Сахаров Редукция нитратов Геновариант, локус, наличие маркерного нуклеотида
Штамм, место и время выделения рамноза, мелибиоза арабиноза 2.МЕБ1, УР02744, Т 2.АОТЗ, УР03506, т 4.АЭТ, УР01418, А З.АЭТ2, УР03183, А О.РЕ4а, УР01548, А О.РЕ4т, УР02223, А 0.РЕ5, УР01120, Т
137(19), Монголия, 1931 - + + - - - + - - -
231(14)*, Монголия, 1931 - + - - - - + - - -
235(21)*, Дзабханский аймак (а/м), 1936 - + - - - - + - - -
236(22), Дзабханский а/м, 1936 - + + - - - + - - -
239(25), Дзабханский а/м,1936 - + - + - - - - - -
И-839, И-840, И-878, И-880, И-899, Убсунурский а/м, 1960, 1962, 1963 - + + - - - + - - -
И-846, И-847, Центральный а/м, 1960 - + + - - - + - - -
И-3101, И-3102, И-3033, И-3030, И-3036, И-3197, И-3217, Хэнтэйский а/м, 1983, 1984, 1988 — + + — + — — — — —
1562, 1864, Баян-Хонгорский а/м, 1956 - + + - - - + - - -
И-3227, И-3230, Монголия, 1988 - + + - + - - - - -
И-3244, Баян-Улегейский а/м, 1988 - + + - - + - - - -
И-3085, Увэр-Хангайский а/м, 1982 + - - - - - - - + -
И-3086, Баян-Хонгорский а/м, 1983 + - - - - - - - - -
И-3068, И-3069, Увэр-Хангайский а/м, 1982 + + - - - - - - - +
И-3130, И-3131, И-3071, Южно-Гобий-ский а/м, 1982, 1984 + + - - - - - - - +
И-2422, Баян-Улегейский а/м, 1974 + + - - - - - - - +
* Штаммы а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.