МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 734-740
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.22.083.3:546.41
АНАЛИЗ Са2+-ОТВЕТА МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ НА ВНЕШНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭКВОРИНА
© 2004 г. О. В. Козлова*, С. Ю. Егоров**, Ф. Г. Куприянова-Ашина**, Ник Рид*, Г. И. Эль-Регистан***
*Эдинбургский университет, Эдинбург **Казанский государственный университет, Казань ***Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 20.04.03 г.
Впервые с использованием мутантного штамма Aspergillus awamori 66A с рекомбинантным Са2+-за-висимым фоточувствительным белком экворином изучена динамика Са в цитозоле микромице-тов, подвергаемых стрессорным воздействиям (повышение уровня внеклеточного Са2+ до 50 мМ, гипоосмотический и механический шок). Установлено, что стрессовый ответ клеток включает повышение уровня Са2+ в цитозоле, что фиксируется по величине, времени подъема и релаксации амплитуды люминесценции экворина. Обнаружены различия в Са2+-ответе клеток на действия различных физиологических стимулов. Результаты применения ингибиторного анализа с использованием различных блокаторов Са2+-каналов, а так же агонистов, специфически повышающих их активность позволили заключить, что: 1) при формировании стрессового ответа повышение уровня Са2+ в цитозоле микромицетов обеспечивается за счет его поступления как из среды роста, так и из внутриклеточных резервуаров; 2) основную роль в поступлении Са2+ в цитозоль клеток микромицетов играют потенциалзависимые транспортные системы.
Ключевые слова: стресс, мицелиальные грибы, Aspergillus awamori, рекомбинантный экворин, динамика Са2+.
В концепции о вторичных посредниках регуляции клеточного метаболизма особое место отводится универсальной роли кальция [1]. Функции Са2+ в качестве мессенджера, участвующего в формировании стрессовых реакций, доказываются тем, что: 1) ответ клетки на какие-либо изменения окружающей среды сопровождается первичным увеличением внутриклеточной концентрации кальция; 2) блокирование поступления Са2+ в клетку ингибирует клеточный ответ; 3) стимуляция процессов, приводящих к увеличению внутриклеточного содержания Са2+, повышает интенсивность ответа на стрессорные воздействия [2].
В клетках эукариот формирование в цитозоле пула внутриклеточного Са2+, вовлеченного в ре-гуляторные процессы, осуществляется двумя путями: в результате его транспорта из окружающей среды и поступлением из клеточных орга-нелл, являющихся его резервуарами. И в том, и в другом случае кальций поступает в цитозоль через специальные каналы в плазматической мембране и мембранах клеточных органелл. В литературе широко представлена информация о Са2+-каналах у млекопитающих и растений [3-5] и очень скудные сведения имеются об этом участнике клеточной регуляции у мицелиальных гри-
бов, что обусловлено, в том числе, различиями в архитектонике клеток низших и высших эукариот.
Наиболее употребимые методы изучения динамики Са2+ в клетке и особенностей функционирования Са2+-каналов основаны на определении различий мембранного потенциала и изотопном анализе транспортируемого 45Са в условиях, изменяющих функционирование Са2+-каналов. Хорошие результаты дает оригинальный метод измерения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме клеток с помощью экворина - Са2+-зависимого фоточувствительного белка, выделенного из медузы Aequorea victoria [6, 7]. Главный недостаток этого метода связан с трудностью введения эквориана в клетки, поэтому создание генетической конструкции, обеспечивающей экспрессию экворина в клетках реципиента, обуславливает качественный скачок в исследованиях кальциевого обмена [8]. Несмотря на достаточный объем методических разработок в изучении механизмов, контролирующих уровень Са2+ в клетке, в этой проблеме остается много неясного, что делает ее одной из наиболее актуальных в современной физиологии. Особенный интерес эти исследования представляют в отношении низших эукариот, в силу малой изученности Са2+-обмена
у мицелиальных грибов. Следует также отметить, что мицелиальные грибы являются хорошей моделью для изучения регуляторной роли Са2+ в клеточной адаптации, так как эти организмы отличаются лабильностью реагирования на стрессорные воздействия [9].
Целью настоящей работы явилось изучение динамики изменений концентрации внутриклеточного Са2+ у Aspergillus awamori под влиянием ряда физиологических воздействий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования был штамм Aspergillus awamori 66А, полученный из лаборатории исследования клеток микромицетов Эдинбургского университета. Штамм A. awamori 66A представляет собой мутант, в котором экспрессирован фотобелок экворин [8].
Экворин при взаимодействии с Са2+ распадается на апоэкворин и селентрамид с выделением энергии в виде света в голубой части спектра, а интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации Са2+ в цитозоле. Фотобелок может быть восстановлен из апоэкворина путем его инкубации с хромофором селентразином. При этом эмиссия света очень невелика по интенсивности, в связи с чем для измерения использовали специальный люминометр (EG&G Berthold LB96P Microlumat), оснащенный фотоумножителем.
Культуру A. awamori 66A выращивали в жидкой среде Вогеля [10] с добавлением 1% сахарозы при температуре 30°C в 96-клеточной матрице. В каждую ячейку матричной планки вносили 100 мкл суспензии спор с начальной концентрацией 5 х 105 кл/мл. После достижения определенной (необходимой) фазы роста культуру микро-мицета инкубировали в течение 4 ч с селентразином для восстановления экворина. Для этого к культуре гриба в каждой ячейке матрицы добавляли селентразин, растворенный в 40 мкл метанола непосредственно перед внесением в клеточную суспензию. Конечная концентрация селентразина составляла 2.5 мкМ. После восстановления экворина в культуры микромицета (в каждую ячейку) вносили растворы испытываемых соединений, приготовленных на среде Вогеля, и/или подвергали стрессовым воздействиям, и затем измеряли эмиссию света с помощью люминометра, выражая ее в относительных световых единицах (ОСЕ).
Для пересчета относительных световых единиц на концентрацию внутриклеточного Са2+ была использована эмпирически полученная формула:
pCa = 0.332588 (-lg k) + 5.5593,
Таблица 1. Влияние физиологических стрессорных воздействий на динамику внутриклеточного Са2+ в клетках А. ам>атоп
Воздействие Параметры Са2+-ответа*
Концентрация Са2+, мкМ Длительность, с**
Внеклеточный Са2+, мМ:
0.05 0.20 ± 0.070 49-51
5.50 0.80 ± 0.069 24-26
Гипоосмотический шок 0.20 ± 0.011 39-40
Механическая стимуляция 0.15 ± 0.009 48-50
Примечание. Результаты - среднее из 5 измерений. * Длительность Са2+-ответа, А = 1/2 Атах с.
где к - отношение люминесценции в конкретный момент времени к общей максимальной люминесценции [11]. Общую максимальную люминесценцию определяли при разложении всего имеющегося в клетке экворина, вызванного добавлением в клеточную суспензию СаС12 до конечной концентрации 1.5 М.
Физиологические стимулы находились в пределах, толерантных для А. амашоп. Высокие концентрации Са2+ создавались дополнительным внесением в среду Вогеля СаС12 до конечного уровня 0.005-50 мМ. Осмотический шок вызывали разбавлением среды в 3 раза, а механический шок -"взбалтыванием" культур на шейкере (140 об/мин) в течение 5 мин. Эксперименты проводили в пятикратной повторности. При обработке полученных результатов применяли метод вариационно-статистического анализа с использованием критерия достоверности Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе с использованием метода люминесценции рекомбинантного экворина была изучена динамика изменений Са2+ в цитозоле клеток микромицета А. амашоп при воздействии на них физиологических стимулов (стрессорных факторов) различной природы: высоких концентраций внеклеточного Са2+, гипоосмотического шока, механического воздействия - "взбалтывания" клеточной суспензии.
В первой серии экспериментов клеточный ответ микромицетов экспоненциальной фазы роста (48 ч) фиксировали по величине амплитуды люминесценции (А) с последующим пересчетом на концентрацию внутриклеточного Са2+. Результаты обобщены в табл. 1. Сразу отметим, что во всех случаях действия различных физиологических стимулов время возрастания внутриклеточного уровня Са2+ составляло около 3 с. Для каждого из воздействий были определены диапазоны
ОСЕ х 104 40 30 20 10
0 0.05 0.025 0.05 0.25 0.5 2.5 5 25 50 Концентрация кальция, мМ
Рис. 1. Влияние концентрации экзогенного CaCl2 на Са2+-ответ (люминесценция экворина) клеток 48-часовой культуры A. awamori, ОСЕ - относительные световые единицы.
ОСЕ х 105 12
10
8
6
4
2
0
т т
□ 1
□ 2
т
24
48 72
Возраст культуры, ч
96
Рис. 2. Зависимость Са2+-ответа (люминесценция экворина) A. awamori от физиологического возраста ми-кромицета при воздействии на клетки CaCl2: 1 - 0.5; 2 - 5 мМ Са .
Концентрация кальция, мкМ 1.0
13 36 60 84 107 130 154 0 25 48 72 95 119 142 Время, с
Рис. 3. Динамика ионов Са в клетках А. ам>ашоп (24 ч) при воздействии на них СаС^: 1 - 0.5; 2 - 5 мМ Са2+.
его количества, вызывающего Са2+-ответ. Например, дополнительное внесение в среду роста ионов Са2+ (СаС12) в пределах 0.005-0.5 мМ не оказывало влияния на изменение внутриклеточ-
ной концентрации ионов кальция. При дальнейшем увеличении содержания Са2+ в среде от 0.5 до 50 мМ его внутриклеточный уровень возрастал экспоненциально (рис. 1).
Кальциевый ответ клетки зависел не только от интенсивности стрессорного воздействия, но и от физиологического возраста микромицетов (рис. 2). Реакция клеток активно растущих культур (24 и 48 ч) на внесение в среду роста СаС12 до конечной концентрации 0.5 и 5.0 мМ была значительно более слабой, чем при воздействии Са2+ в этих же концентрациях на клетки стационарной культуры (72 ч), в которых резко стимулировалось его внутриклеточное накопление. В этих вариантах световая эмиссия достигала величины 0.8-1.0 х 106 ОСЕ, а в ряде экспериментов - 1.2 х х 106 ОСЕ, что позволяло наблюдать люминесценцию невооруженным глазом. В клетках поздней с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.