МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 726-741
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.113.6
АНАЛИЗ СОВЕРШЕННЫХ И МИСМАТЧЕВЫХ ДНК-ДУПЛЕКСОВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛНОГО ГЕКСАНУКЛЕОТИДНОГО МИКРОЧИПА
© 2003 г. Е. Б. Хомякова, М. А. Лившиц*, А. Ю. Шаронов, Д. В. Прокопенко,
А. Д. Мирзабеков
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 23.01.2003 г.
Представлен термодинамический анализ дуплексов, сформированных флуоресцентно меченными олигонуклеотидами-мишенями на полном гексануклеотидном микрочипе. В качестве зондов в отдельных гелевых ячейках микрочипа иммобилизованы все 4096 различных шестинуклеотидных цепочек. Для усиления гибридизации к каждому шестичленнику в качестве неселективных "скрепок" добавлены по одному 3'- и 5'-концевому нуклеотиду из эквимолярной смеси всех четырех нуклеоти-дов. Показано, что кривые плавления олигонуклеотидных дуплексов, образованных на микрочипе и в растворе, весьма сходны. Исследовано влияние ионного окружения на эффективность гибридизации и на дискриминацию мисматчевых дуплексов от совершенных. Изучена возможность компенсации зависимости прочности дуплексов от ОС-состава. Показано, что эффективным в сглаживании АТ/ОС-различий является использование хаотропных агентов, добавление немеченных ОС-богатых олигонуклеотидов-конкурентов, а также использование температурного градиента вдоль микрочипа, воспроизводящего распределение температур плавления. Сглаживание с помощью хлористого тетраметиламмония сопровождается некоторым ослаблением дискриминации мисматчевых дуплексов от совершенных.
Ключевые слова: ДНК, гибридизация, олигонуклеотиды, микрочипы.
Свойства олигонуклеотидных микрочипов зависят от их назначения и особенностей технологии их изготовления. Микрочипы, предназначенные для частных задач генной диагностики или для уточнения определенных нуклеотидных последовательностей, могут содержать ограниченный набор олигонуклеотидов, достаточный для определения немногих оснований внутри известной, в целом, нуклеотидной последовательности. В отличие от этого полный микрочип, пригодный для широкого спектра приложений, включая сек-венирование de novo, должен содержать полный набор олигонуклеотидов определенной длины.
Используемый нами полный микрочип содержит набор всех 4096 = 46 гексануклеотидов. Каждый гексануклеотид химически пришит внутри отдельной ячейки из полиакриламидного геля, закрепленной на стеклянной пластинке. Размеры гелевых ячеек 100 х 100 х 20 мкм. Олигонуклеотиды синтезированы с помощью автоматизированного синтезатора и перед нанесением с помощью робота в гелевые ячейки дополнительно очищены [1]. Это гарантирует высокую степень
Принятые сокращения: ТМА - тетраметиламмоний, TR -"техасский красный", ГБ - гибридизационный буфер, Tm -температура плавления.
* Эл. почта: Livshits@eimb.ru
однородности иммобилизованных олигонуклеотидов, недостижимую в технологии "синтеза on site" [2]. Трехмерное распределение иммобилизованных олигонуклеотидов по всему объему гелевых ячеек определяет существенное отличие этих микрочипов. Значительное преимущество трехмерной иммобилизации по сравнению с двумерной иммобилизацией на поверхности стекла или пластика состоит в более высокой (на два-три порядка) плотности иммобилизованных олигонуклеотидов на единицу площади. В то же время расстояние между молекулами олигонуклеотида достаточно велико, чтобы исключить взаимодействие иммобилизованных или анализируемых молекул. Известно, что такое взаимодействие на двумерных микрочипах искажает гибридизацию [3]. Процессы в трехмерных ячейках подобны таковым в водном растворе и резко отличаются от гетерофазных процессов на поверхности двумерных микрочипов.
Для того чтобы следить за гибридизацией, как и в большинстве других микрочиповых технологий, используется флуоресцентное мечение исследуемых молекул.
Кинетика гибридизации на микрочипах с молекулами зонда, иммобилизованными в слое геля, определяется особым механизмом - "задержан-
ной диффузией" [4]. Он может быть описан как постепенная миграция ДНК в гель, прерываемая временным присоединением к иммобилизованным молекулам олигонуклеотида. Кинетика этого процесса, зависимая от силы связывания, проявляет характерное свойство: чем выше сродство, тем медленнее гибридизация.
Для увеличения эффективности гибридизации на нашем полном микрочипе все гексануклеотиды снабжены неселективными "скрепками". А именно, вместо определенного 6-мера в каждую ячейку микрочипа помещали эквимолярную смесь шестнадцати 8-меров, содержащих данный 6-мер в середине и любое из четырех оснований (А, Т, в, С) на каждом конце. В качестве неселективных стабилизаторов дуплексов можно использовать также "универсальные основания", такие как 5-нит-роиндол [5]. Эксперименты показали значительно повышенную эффективность гибридизации с "продленными 6-мерами". В то же время сохранилась достаточная эффективность дискриминации, т.е. разница в стабильности между вполне комплементарными и мисматчевыми (в пределах "значимого" 6-мера) дуплексами. Кроме того, первое и шестое основания "значимого" 6-мера из почти не дискриминирующих концевых превращаются в"продленном 6-мере"в предпоследние, приобретая способность отличать комплементарные основания от некомплементарных.
Полный микрочип дает возможность измерять одновременно кривые плавления для множества различных олигонуклеотидных дуплексов. Такие данные могут быть использованы для анализа относительной стабильности дуплексов и для разработки надежных алгоритмов дискриминации мис-матчей. Однако следует заметить, что данные по плавлению дуплексов, сформированных на "продленных 6-мерах" (т.е. на смесях 8-меров), трудно использовать для количественного исследования термодинамики индивидуальных олигонуклеоти-дов.
Стабильность дуплексов зависит от их АТ/вС-состава столь сильно, что АТ-богатые совершенные дуплексы могут быть менее стабильными, чем вС-богатые мисматчевые. Это осложняет анализ гибридизационных данных. Мы попытались сгладить зависимость эффективности гибридизации от вС-состава. Одним из довольно успешных подходов оказалось добавление к гибридизацион-ному буферу хлористого тетраметиламмония, эффективность которого в сглаживании АТ/вС-различий для более длинных дуплексов в растворе была известна [6, 7]. Другой многообещающий подход - добавление смеси немеченных вС-богатых олигонуклеотидов, конкурирующих с гибри-дизационным материалом. Наконец, мы предла-
гаем компенсировать AT/GC-зависимость эффективности гибридизации, создавая вдоль микрочипа градиент температуры, который воспроизводил бы распределение температур плавления (Гт) в ряду ячеек, расположенных в порядке возрастания GC-содержания иммобилизованных олигонуклеотидов.
Ранее мы разработали метод параллельного измерения равновесных кривых плавления дуплексов, образованных в разных гелевых ячейках микрочипа [5]. Такие кривые могут использоваться и для термодинамического анализа множества олигонуклеотидных дуплексов, и для дискриминации несовершенных дуплексов. Алгоритмы дискриминации, сопоставляющие стабильность дуплексов по измеренным кривым плавления [8], а не по единичным флуоресцентным данным, характеризуются высокой надежностью.
Мы представляем данные по плавлению олигонуклеотидных дуплексов различного GC-соста-ва, образованных гибридизацией на полном микрочипе. Анализируется влияние ионного окружения (Na+, Li+, TMA+, Mg2+, Mn2+) и эффект добавления немеченных олигонуклеотидов в качестве конкурентов. Кривые плавления, измеренные на микрочипе, сравниваются с кривыми для таких же дуплексов в растворе.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Олигонуклеотиды. Комплект 4096 октанукле-отидов, использованных при изготовлении полного микрочипа, приобретен у CyberSyn (Aston, PA, США). Эти 8-меры имеют общую структуру 5'-NH2-MNNNNNNM, где M - это1 : 1 : 1 : 1 смесь четырех оснований и N - одно из четырех оснований "значимого ядра", варианты которого представляют все возможные 4096 гексамеров. Для иммобилизации 8-меров в полиакриламидном геле использован амино-линкер через цепочку С6 (5'-Amino-Modifier C6, "Glen Research", США).
Олигонуклеотиды 5'-NH2-MAACTGAM, 5'-NH2-CAACTGAC и 5'-NH2-GAACTGAG, иммобилизованные на специальном микрочипе для термодинамического анализа, а также "испытываемые" олигонуклеотиды, использованные для гибридизации на микрочипах, 5'-CTCAGTTC-NH2, 5'-TAAATTAT-NH2, 5'-CGGGCCGC-NH2, снабженные амино-линкером (3'-Amino-Modifier C7-CPG, "Glen Research", США), и 5'-(C\G) (C\G) (C\G) (C\G) (C\G) (C\G) (C\G) (C\G) синтезированы на Applied Biosystems 394 DNA/RNA - синтезаторе (США) с использованием стандартной фосфора-мидитной химии.
Флуоресцентное меченне олигонуклеотидов "техасским красным" (Texas Red sulphonyl chloride dye (TR); Molecular Probes, Eugene, OR) через концевую аминогруппу выполнено по протоколу производителя. Меченые олигонуклеотиды очищены в 20%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. TR выбран как флуресцент-ная метка для термодинамических исследований потому, что интенсивность его флуоресценции почти не меняется с температурой (вариация менее 5% в интервале 5-60°с) [9].
Олигонуклеотиды 5'-MGCGGCCM-NH2, 5'-MCGGGCTM-NH2, 5'-MTCGGGTM-NH2, 5'-MTCG-GTAM-NH2, 5'-MATTGCAM-NH2, 5 '-MTTTGTTM-NH2, 5'-MAATTATM-NH2 для изготовления "градиентного" микрочипа и комплементарные им TR-меченные гибридизационные партнеры приготовлены с использованием тех же процедур.
Молярные концентрации немеченных олигонуклеотидов вычисляли по оптической плотности при длине волны 260 нм и 80°C с использованием среднего молярного коэффициента экстинкции основания [10]. В случае меченых олигонуклеотидов поглощение при 260 нм учитывали как 30% поглощения при 590 нм.
Олигонуклеотидные микрочипы. Микрочипы приготавливали в два этапа. Сначала фотополимеризацией создавали ряды полиакриламидных ячеек с размерами 100 х 100 х 20 мкм, разделенные промежутками 200 мкм [11]. Затем стекло гидрофобизовали [1] и в гелевые ячейки наносили растворенные в воде до концентрации 2.5 мМ олигонуклеотиды, по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.