ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 450, № 5, с. 602-605
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.
АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ КООПЕРАТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОГО СЕНСОРА IRR
© 2013 г. Н. В. Попова, И. Е. Деев, А. Г. Петренко
Представлено академиком А.И. Мирошниковым 08.10.2012 г. Поступило 15.10.2012 г.
DOI: 10.7868/S0869565213170234
Рецептор, подобный инсулиновому рецептору (insulin receptor-related receptor, IRR), является тирозинкиназой и принадлежит к семейству рецептора инсулина, в которое входит сам рецептор инсулина (IR) и рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR). Ранее нами было показано, что рецептор IRR активируется при повышении pH внеклеточной жидкости больше 8.0 и является сенсором внеклеточного щелочного pH в организме. При этом кооперативность при активации рецептора IRR агонистом является положительной, тогда как для рецептора инсулина она отрицательна. В данной работе был проведен анализ способности активироваться щелочным рН химерной молекулы IRR, содержащей три домена рецептора IGF-IR в области внеклеточной части. Данный химерный рецептор сохраняет способность активироваться щелочным pH, но при этом кооперативность процесса активации сильно снижается.
Семейство инсулинового рецептора состоит из самого рецептора инсулина (IR), рецептора инсу-линоподобного фактора роста (IGF-IR) и рецептора, подобного инсулиновому рецептору (insulin receptor-related receptor, IRR). Все три рецептора являются высокогомологичными [1, 2]. Во внеклеточной N-концевой части а-субъединицы всех трех рецепторов содержатся домены L1 и L2 (богатые лейцином), между которыми расположен домен C (фурин-подобный, богатый цистеи-ном). Тирозинкиназный домен находится в цито-плазматической части Р-субъединицы.
Предполагается, что дупликация и разделение генов, кодирующих IGF-IR и IRR, произошла эволюционно позднее, чем отделение гена рецептора инсулина [2], поэтому степень гомологии между IGF-IR и IRR несколько выше, чем между IR и IRR [1].
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва
Связывание пептидного лиганда с внеклеточной частью IR или IGF-IR вызывает конформа-ционные изменения, которые приводят к авто-фосфорилированию остатков тирозина, расположенных в цитоплазматическом тирозинкиназном домене. Различными методами было показано, что функциональные участки, отвечающие за связывание лигандов с IR и IGF-IR, расположены во внеклеточных доменах L1 и C (для обзора [3]). Нами было показано, что IRR в отличие от его гомологов способен активироваться не под действием лиганда белковой природы, а при повышении рН внеклеточной жидкости больше 8.0 [4, 5]. У мышей с направленной инактивацией гена insrr, кодирующего рецептор IRR, наблюдалось нарушение регуляции кислотно-щелочного равновесия [8].
Мы показали, что основные участки, обусловливающие pH-чувствительность, располагаются в первых двух доменах L1C [5]. Более того, в отличие от гомологичных IR и IGF-IR активация IRR происходит с положительной кооперативностью (коэффициент Хилла около 3) [5], тогда как при активации инсулином и инсулиноподобным фактором роста соответствующих рецепторов наблюдается отрицательная кооперативность [6, 7].
В данной работе в молекуле IRR исследованы структурные детерминанты, определяющие чувствительность рецептора к щелочному pH, с использованием химерного рецептора, в котором первые три домена внеклеточной части IRR были заменены соответствующими доменами его наиболее близкого гомолога IGF-IR. Данная химера частично сохранила чувствительность к слабощелочной среде, однако сравнительный анализ кривых рН-зависимости активации IRR и полученного химерного рецептора выявил заметное снижение положительной кооперативности (почти двукратное уменьшение коэффициента Хилла) взаимодействия с гидроксилами химерного рецептора. Это свидетельствует о многоточечном механизме конформационных изменений в экто-домене IRR в ответ на повышение рН.
АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ
603
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение химерного рецептора. Химерный рецептор L1CL2(IGF-IR) IRR-HA получали полиме-разной цепной реакцией (ПЦР) с использованием следующих праймеров: 5'-gggGGTACCGAAT-TCATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAG и 5'-cccGG-tACcCGTCACTTCCTCCATGCGGTAA. Правильность конструкции проверяли секвенированием.
Трансфекция эукариотических клеток, биотини-лирование и активация рецептора. Клетки HEK293 растили на среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и 2 ммоль Z-глутамина при стандартных условиях (37°С и 5% CO2). Клетки трансфецировали плазмидами pcDNA3.1, кодирующими IRR-HA или химерный рецептор. Для трансфекции использовали унифектин-56 ("Uni-fectGroup") согласно рекомендациям производителя. Через 28—40 ч после трансфекции клетки оставляли в бессывороточной ростовой среде на 2—3 ч при стандартных условиях. При необходимости биотинилирования внеклеточных частей белков клетки инкубировали в PBS с 0.5 мМ EZ-Link NHS-LC-Biotin ("Pierce") в течение 30 мин в CO2-инкубаторе, промывали 3 раза PBS c 100 мМ глицином, а затем лизировали в буфере (20 мМ Hepes-KOH, pH 7.3, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 5 мМ EDTA, 1 мМ PMSF). Нерастворившийся материал осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 15 000g и 4°С. Аликвоту суперна-танта наносили на SDS-ПААГ или использовали для преципитации с антителами против IRR. К супернатанту добавляли кроличью сыворотку, содержащую антитела к C-концевой части IRR, в разведении 1 : 500, инкубировали в течение ночи при умеренном перемешивании (4°С), а затем образовавшиеся иммунокомплексы осаждали с использованием белкаА-агарозы.
Для проверки активации рецепторов и получения кривых активации клетки HEK293, экспрес-сирующие рецепторы, после "голодания" в бессывороточной среде инкубировали в PBS с 60 мМ Tris-HCl c требуемым значением pH в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем буфер отбирали и клетки незамедлительно лизировали в 1х-буфере для электрофореза в ПААГ в присутствии SDS.
Вестерн-блот и построение кривых активации.
Электрофорез в 8% ПААГ в присутствии SDS и последующий вестерн-блот-анализ проводили по стандартному протоколу, как описано в [9]. Для детекции общего количества рецепторов использовали кроличью сыворотку к цитоплазматической части IRR (anti-C-IRR serum), а для выявления фосфорилированной формы рецептора применяли кроличью сыворотку к фосфорилированному IRR (anti-pIRR serum). Антитела к IRR были получены в нашей лаборатории и описаны в [5]. В ка-
честве вторичных антител использовали антитела козы против иммуноглобулинов кролика, конъ-югированные с HRP ("Jackson ImmunoRe-search"). Для детекции биотинилированных белков использовали стрептавидин, конъюгирован-ный с HRP ("Sigma").
Полученные блоты сканировали, и специфичные сигналы обрабатывали с помощью программы ImageJ. Сигнал от антител к фосфорилированному IRR нормировали по сигналу от антитела против С-конца рецептора IRR. Далее полученные отнор-мированные сигналы для каждого рН (n > 3) обрабатывали в программе GraphPad Prism 5 с использованием интерполяции уравнения Хилла (One site — Specific binding with Hill slope-анализ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для выявления в IRR домена, отвечающего за pH-чувствительность, был получен химерный рецептор, в котором первые три домена (L1CL2) IRR были заменены соответствующими доменами рецептора IGF-IR. Как уже упоминалось, IGF-IR является более близким гомологом IRR по сравнению с рецептором инсулина (IR). Этот факт позволяет предполагать, что структура полученного химерного белка будет нарушена в минимальной степени. Схематично IRR и полученная химера L1CL2(IGF-IR)IRR представлены на рис. 1а.
Белки экспрессировали в эукариотических клетках HEK293. Клетки, трансфецированные указанными на рис. 1б и 1в конструкциями, био-тинилировали, а затем лизировали. На рис. 1б представлен иммуноблот тотальных клеточных белков с антителами против ß-субъединицы рецептора IRR. Видно, что химерный рецептор экспрес-сируется в эукариотических клетках и успешно про-цессируются эндопротеазой. Чтобы убедиться, что полученный химерный рецептор выходит на поверхность клеток, внеклеточные части белков после экспрессии в эукариотических клетках были биотинилированы. После лизиса клеток была проведена иммунопреципитация рецепторов антителами к внутриклеточной части IRR и детекция вестерн-блот-анализом со стрептавидином-HRP (рис. 1в). Таким образом, мы подтвердили, что полученный химерный рецептор при экспрессии в эукариотических клетках процессиру-ется и выходит на поверхность клетки.
Мы проверили, способен ли полученный химерный рецептор активироваться в ответ на повышение pH внеклеточной среды. Для этого эукариоти-ческие клетки, в которых были экспрессированы IRR или L1CL2(IGF-IR)IRR, обрабатывали буфером с pH 7.3 или 9.0. Клетки затем лизировали, белки разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллю-лозную мембрану для проведения вестерн-блот-анализа с антителами против ß-субъединицы ре-
604
ПОПОВА и др.
(а)
L1 C L2 TM TRK
L1 C L2 TM TRK
hIRR
L1CL2(IGF-IR) IRR-HA
Рис. 1. Схематическое изображение и экспрессия рецепторов в эукариотических клетках. а — белым цветом обозначены домены IRR, серым — домены IGF-IR. L1 и L2 — L-домены, С — фуринподобный богатый цистеином домен, TM — трансмембранный домен, TRK — тирозинкиназный домен, HA — гемагглютининовый таг. б — иммуноблот тотальных клеточных белков с антителами против ß-субъединицы рецептора IRR. в — окрашивание стрептавидином образцов после иммунопреципитации антителами к IRR. К — НЕК293 без трансфекции; ß — бета-субъединица IRR.
HEK293 HEK293
Рис. 2. Активация рецепторов щелочным pH. Клетки HEK293, экспрессирующие указанные белки, обрабатывали буфером с pH 7.3 или 9.0. ß-субъединицы детектировали антителами к C-концевой части IRR (а), а фосфорилированный рецептор — антителами к фосфорилированной форме IRR (б). К — HEK293 без трансфекции; ß — бета-субъединица IRR.
цепторов (рис. 2а) или фосфорилированной формы рецептора (рис. 2б).
Как было показано ранее, IRR активируе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.