ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, № 3, с. 163-184
== ОБЗОРЫ
УДК 591
АНАЛИЗ ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК: СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ И МЕТОДЫ1
© 2009 г. П. В. Дмитриев*, E. C. Васецкий*'**
*Университет Париж-11, Институт им. Гюстава Русси, Виллежюиф, Франция
CNRS UMR 8126 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail:vassetzky@igr.fr; dmitriev@igr.fr Поступила в редакцию 01.07.08 г.
Терминальные участки линейных хромосом эукариотических организмов представлены теломер-ной ДНК и рядом ассоциированных с ней специфических белков. Длина, последовательность и структура теломерной ДНК являются одними из важнейших параметров теломер. Для анализа этих параметров используют набор специфических молекулярно- и клеточно-биологических, а также генетических методов, наиболее значимые из которых описаны в обзоре.
Ключевые слова: теломерная и субтеломерная ДНК, клонирование и секвенирование теломерной ДНК, измерение длины и визуализация теломерной ДНК, пространственная структура теломерной ДНК.
О специфических функциях концов хромосом было известно задолго до открытия молекулярной природы ДНК. Мюллер и Мак-Клинток (Muller, 1938; McClintock, 1941) цитологически охарактеризовали терминальные участки хромосом дрозофилы и риса и предложили термин "тело-мера" (от греч. "telos" - конец и "meros" - часть). Позднее открытие структуры ДНК и механизма полуконсервативной репликации генома (Watson, Crick, 1953; Meselson, Stahl, 1958) позволило Олов-никову высказать гипотезу об укорочении теломерной ДНК в результате каждого акта репликации хромосом (Olovnikov, 1971, 1973). Гипотеза Оловни-кова получила экспериментальное подтверждение в работах Харли с соавт. (Harley et al., 1990), более того, она легко объяснила существование лимита Хейфлика - феномена самоограничения клетками своего пролиферативного потенциала (Hayflick, Moorhead, 1961). Появление методов анализа первичной структуры ДНК позволило Блэкберн и Гол-лу (Blackburn, Gall, 1978) установить, что теломерная ДНК представляет собой серию тандемно повторяющихся коротких G/T-богатых последовательностей (рис. 1, а). Это в свою очередь позволило высказать предположение о существовании
1 Работа поддержана Французской ассоциацией против миопатий (Association francaise contre Ies myopathies, AFM), Фондом Франции (Fondation de France, FdF), а также Международным проектом научного сотрудничества (Project InternationaI de Cooperation Scientifique, PICS3207 (CNRS-РФФИ)).
терминальной трансферазы, проводящей циклическое удлинение теломер, необходимое для компенсации их неполной репликации (Shampay et al., 1984). Открытие фермента "теломеразы" (Greider, Blackburn, 1985) явилось подтверждением и этой гипотезы.
В настоящее время важнейшими функциями теломер считаются стабилизация концов хромосом и ограничение пролиферативного потенциала клеток. Концы хромосом, защищенные тело-мерами, не распознаются системой репарации двухцепочечных разрывов и не вызывают остановки клеточного цикла. Кроме того, теломеры играют важную роль в ходе мейоза, облегчая узнавание гомологичных хромосом и рекомбинацию между ними. Уровень экспрессия каталиче-ской субъединицы теломеразы и длина теломер зависят от стадии развития и могут отличаться у разных тканей и клеток одного организма. Нарушения регуляции теломеразы могут приводить к различным порокам развития, например дефектам формирования нервной системы. Подробно о функциях теломер и их роли в развитии организма см. в обзорах: Dmitriev et al., 2003; Bekaert et al., 2004; Kuimov, 2004; Harrington, 2004; Gilson, Geli, 2007.
В настоящем обзоре мы рассматриваем методы анализа теломерной ДНК, включая клонирование и секвенирование, анализ пространственной структуры и визуализацию теломерной ДНК,
S. cerevisiae X
ds
.... 3'
H. sapiens
i—ESM
ds
теломера
теломера
s ^ /\М
■Л :/ '■'■ i
Рис. 1. Структура теломерной ДНК: а - сходное строение теломер различных организмов; б - одна из возможных структур одноцепочечного участка теломерной ДНК ^-квартетная шпилька); в - Г-петля.
Теломерная ДНК пекарских дрожжей 5. cerevisiae состоит из двухцепочечного участка длиной 375 п.н., имеющего нерегулярную первичную структуру TG1-з/AC1-з, и одноцепочечного участка - продолжения G-богатой цепи; в суб-теломерных участках хромосом дрожжей расположены повторяющиеся элементы X и Y'. Теломерная ДНК человека имеет регулярное строение (T2AGз/A2TCз), длина двухцепочечного участка составляет от 3 до 50 т.п.н., одноцепочеч-ный участок также является продолжением G-богатой цепи. Строение субтеломерных областей хромосом человека изучено не полностью.
а
а также методы селективного измерения длины одно- и двухцепочечного участков теломер.
КЛОНИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ
ТЕЛОМЕРНОЙ И СУБТЕЛОМЕРНОЙ ДНК
Впервые сведения о нуклеотидной последовательности теломерной ДНК были получены Блэкберн и Голлом при изучении хромосом макронуклеуса инфузории тетрахимены Tetrahymena thermophila (Blackburn, Gall, 1978). Тетрахимена предоставила ученым уникальный шанс определить первичную структуру теломер, не прибегая ни к клонированию, ни к секвенированию ДНК. Дело в том, что на одной из стадий развития тетрахимены гены рРНК существуют в виде 200 идентичных линейных мини-хромосом (Brown et al., 1990). В мини-хромосомах, которые можно легко отделить от обыкновеннной геномной ДНК, заметную долю (около 3%) составляет теломерная ДНК. На начальном этапе Блэкберн и Голл обнаружили, что, благодаря наличию одноцепочеч-ных разрывов (ников), теломеры тетрахимены можно специфически пометить методом ник-трансляции, причем для этого достаточно лишь двух из четырех нуклеотидов (dATP и dCTP). Последнее возможно лишь в том случае, если комплементарная цепь теломерной ДНК содержит только остатки гуанина и тимина (TxGy). На следующем этапе авторы депуринизировали и гидроли-зовали теломерную ДНК, а затем разделили полученные фрагменты с помощью тонкослойной хро-
матографии. Анализируя полученные фрагменты гидролиза теломерной ДНК, ученым удалось вычислить первичную структуру теломерного повтора тетрахимены - T2G4 (Blackburn, Gall, 1978). Позднее аналогичным методом удалось выяснить первичную структуру теломерного повтора трипаносомы Trypanosoma brucei - (TTAGGG)n (Blackburn, Challoner, 1984). Два года спустя после публикации пионерской работы Блэкберн и Голла в лабораторную практику был введен метод химического секвенирования ДНК Максама и Гилберта (Maxam, Gilbert, 1980). Это позволило другим ученым секвенировать терминальные участки мини-хромосом инфузорий Euplotes aediculatus и Stylony-chia pustulata (Klobutcher et al., 1981).
Вскоре после определения первичной структуры теломерную ДНК тетрахимены удалось клонировать. Оказалось, что теломеры тетрахимены сохраняют свою функцию в пекарских дрожжах Saccharomyces cerevisiae - одном из наиболее удобных для генетических манипуляций эукарио-тическом организме. Это наблюдение позволило впервые создать линейную плазмиду, способную стабильно реплицироваться в дрожжах благодаря наличию на концах теломерных повторов тетрахимены (Szostak, Blackburn, 1982). С помощью этой принципиально новой плазмиды ученым удалось впервые клонировать, а затем и секвенировать теломеры самих дрожжей S. cerevisiae. Для этого оказалось достаточно заменить одну из теломер тетрахимены на различные фрагменты геномной ДНК дрожжей и отобрать те из них, которые способны
R R
R
^номтая ДНК
Half-YAC
Pecтpиктaзa R, лигиpoвaниe
R R
Эндoнyклeaзa, Úpame»! Kлeнoвa R R
лигaзa
R R
R +
плaзмидa
R,
R лигaзa
R
R
RR
R
интeгpaция
R R
R
R, лигaзa
Рис. 2. Методы клонирования теломерной и субтеломерной ДНК.
а - способность теломерной ДНК человека выполнять свою функцию в клетках дрожжей: теломеры человека стабилизируют Half-YAC, благодаря чему их легко клонировать в дрожжах; б - возможность "маркировать" теломеры, ли-гируя с концами хромосом линеаризованную плазмиду, благодаря тому, что теломерная ДНК расположена на конце хромосомы; в - создание штаммов, в которых одна из теломер маркирована при помощи интегрированной плазмиды; интеграцию плазмид проводили в двухцепочечный участок теломерной ДНК (Louis, Borts, 1995).
а
+
стабилизировать линейную плазмиду, т.е. выполнять функцию теломер (Szostak, Blackburn, 1982). Спустя два года удалось установить первичную структуру теломерной ДНК дрожжей - TG1-3 (Shampay et al., 1984) (рис. 1, а). Позднее по методу Жостака удалось клонировать и теломеры других организмов, например, человека (Brown, 1989; Cross et al., 1989; Riethman et al., 1989) (рис. 1, а), мыши (Kipling et al., 1995), Arabidopsis thaliana (Richards, Ausubel, 1988), Chlamidomonas reinhardtii (Hails et al., 1995) и кукурузы (Gardiner et al., 1996).
Наряду с клонированием функциональных теломер в дрожжевых линейных векторах были разработаны и другие методы (рис. 2), эксплуатирующие уникальные свойства теломерной ДНК, а именно ее расположение на физических концах хромосом. Если геномную ДНК обработать экзо-нуклеазой и фрагментом Кленова, а затем лиги-ровать с линеаризованой плазмидой, то все терминальные участки хромосом окажутся "сшиты" c плазмидой (разумеется, такая процедура не разли-
чает настоящий конец хромосомы от случайного двухцепочечного разрыва). После этого продукт лигирования обрабатывают ферментом рестрикции, переводят в кольцевую форму с помощью лигирования и трансформируют в клетки E. coli (рис. 2, •). С помощью такой стратегии удалось впервые клонировать теломеры Trypanosoma brucei (Blackburn, Challoner, 1984; Van der Ploeg, Cornelissen, 1984), Plasmodium berghei (Ponzi et al., 1985), Arabi-dopsis thaliana (Richards, Ausubel, 1988).
Принципиально похожий подход предполагает "пришивание" к концам хромосом специального линкера, облегчающего клонирование в бактериальный вектор. Именно таким способом были впервые клонированы теломеры Dyctyostelium (Emery, Weiner, 1981) и Paramecium (Baroin et al., 1987).
Отдельно хотелось бы упомянуть о принципиально иной стратегии. Как известно, для повторов, в отличие от уникальных последовательностей генома, характерна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.