БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 6, с. 1097-1100
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 597,585:591.111.1
АНАЛИЗ ТЕПЛОВЫХ ЯВЛЕНИЙ В ЭРИТР ОЦИТАХ СКОР ПЕНЫ (Scorpaena porcus L.)
© 2014 г. Ю.А. Силкин, Е.Н. Силкина, А.Я. Столбов*
*Карадагский природный заповедник, 298188, п. Куротное, ул. Науки, 24, Республика Крым; **Институт биологии южных морей им. А .О. Ковалевского, 299011, Севастополь, просп. Нахимова, 2, Республика Крым E-mail: ysilkin@mail.ru Поступила в p едакцию 12.08.14 г.
Исследована cпоcобноcть эpитpоцитов моpcкой костистой pb^bi c^p^^i (S. рогсш L.) к теплопpодукции в условиях in vitro. Показано, что cуcпензии отмытые эpитpоцитов в течение пpодолжительного вpемени пpодyциpyют тепло, а пpи добавлении дополнительного внеклеточного АТФ наблюдалось явление теpмоcкачка. П pедполагаетcя, что наблюдаемый эффект обеспечивается за cчет pаcщепления АТФ c выделением тепловой энеpгии экто-АТФазой плазматичеcкой мембpаны эpитpоцитов p ыб.
Ключевые слова: теплопродукция, термоскачок, экто-АТФаза, эритроциты, рыбы.
Pанее нами было показано, что плазмати-чеcкие мембpаны ядерных эpитpоцитов моpcкиx рыб cодеpжат большой пул выcокоактивной экзо-АТФазы, локализованной на внешней по-веpxноcти цитоплазматичеcкой мембp аны эрит-pоцита [1]. C убcтp атами для этиx АТФаз может быть как cекpетиpуемая эpитpоцитами АТФ, так и АТФ, пpиcутcтвующая в плазме кpови pыб. В чаcтноcти, эpитpоциты cодеpжат значительную внутpиклеточную концентpацию АТФ [2,3], и факт cекpеции АТФ ядеpными и безъядеpными эpитpоцитами был экcпеpимен-тально доказан [4]. Cледует отметить, что гидролиз АТФ АТФазами - это зкзотермическая реакция, т.е. реакция, сопровождающаяся выделением теплоты. В этом случае наличие большого пула экзо-АТФаз в плазматической мембране эритроцитов и присутствие достаточного количества субстрата (АТФ) должны приводить к выделению значительных количеств тепла как интактными эритроцитами, так и АТФ-стимулированными клетками. Настоящая работа направлена на изучение тепловых эффектов в эритроцитах и их возможной роли в функционировании эритроцитов в крови рыб.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили эритроциты костистой рыбы - скорпены (5сограепа рог-сш Ь.). Цельную кровь получали путем пункции хвостовой вены, в качестве антикоагулянта использовали гепар ин (50 ед./мл крови). Эр итро -
циты трижды отмывали от плазмы в десятикратном объеме изотоничного раствора следующего со става: 180 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl-буфера (рН 7,4), охлажденного до 4°C. Осаждение клеток пр оводили путем центр ифу-гирования в центрифуге ОПн-8 (5000 об/мин, 10 мин). Надосадочную жидкость декантировали. C помощью фильтр овальной бумаги аккуратно удаляли слой лейкоцитов, расположенный на поверхности осажденных эритроцитов. После отмывания эр итроциты ресуспендирова-ли в небольшом количестве изотонического раствора . Гематокрит полученной суспензии опр е-деляли на гематокритной центрифуге TL-11 (Германия). Эритроциты помещали в пластиковую ячейку объемом 5 мл со средой инкубации, оптимальной для функционирования эк-то-АТФазы, следующего состава: 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 6 мМ MgCl2, 50 мМ трис-HCl, рН 7,4. В опытах использовали суспензии клеток с конечным гематокритом, составляющим 25%.
Установка по измерению теплопродукции эритроцитов была разработана в Институте биологии южных морей (ИнБЮМ) НАНУ г. Cеваcтополь [5]. Она со стояла из ячейки, помещенной в сосуд Дьюара, который нахо-дился в теплоизоляционном боксе. В крышку ячейки были вмонтированы термодатчик HELL-700 и силиконовая микротр убка, которая была выведена через специальные ходы пробки сосуда Дьюара и стенки на поверхность теплоизоляционного бокса. Трубка соединялась со
Pис. 1. Термограмма изменения температуры в суспензии свежеотмытых эритроцитов. На врезке - участок тер могр аммы, хар актер изующий тер москачок экспер имента.
шпр ицем, котор ый в пр оцессе экспер имента использовали для добавления аликвоты АТФ (0,5 мл), содер жащей 5 мг АТФ. Тер модатчик HELL-700 диаметр ом 1,5 мм позволял пр ово-дить измерение температуры с точностью до 0,0001°С. Темпер атур ные пар аметр ы р егистр ир овали на компьютер е и конвертир овали в пр о -гр амму Ехсе1, пр и помощи котор ой пр оводи-лась их статистическая обработка и построение г р афиков.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Графики теплограмм суспензий эритроцитов скор пены, полученные в пр оцессе экспер и-ментов, пр едставлены на р ис. 1-3. Как видно из рис. 1, темпер атурный датчик, помещенный в суспензию эр итр оцитов, р еги стр ир овал устойчивый линейный прирост температуры в ячейке в течение почти полутор а часов. За этот пер иод пр ир о ст темпер атур ы в ячейке со ставил 0,0287°С (0,0191 гр ад/ч). Добавление к суспензии 5 мг АТФ приводило к резкому повышению темпер атур ы, котор ое мы опр еделили как термоскачок. Через 60 с, в течение которых термоскачок до стигал своего максимума, пр ир о ст темпер атур ы со ставил 0,0454°С, что более чем на 50% пр евышало повышение темпер атур ы за предыдущий час наблюдений (рис. 1а). После этого в течение 10-ти минут темпер атур а в области датчика снижала сь до до стижения равновесного со стояния, но ее значение было на 0,0079°С выше, чем до добавления АТФ. В
течение по следующего вр емени (около часа) еще наблюдался пр оцесс линейного пр ир о ста темпер атуры со скор остью 0,0256 гр ад/ч.
Способность эритроцитов рыб продуциро-вать тепло в течение почти тр ехчасового экспер имента свидетельствовала о больших потенциальных возможностях этих клеток, но этот пр оцесс, как мы полагали, должен был лими-тир оваться внутр иклеточными запа сами АТФ. Чер ез 12 ч после начала экспер имента (р ис. 2) мы не наблюдали пр ир о ста темпер атур ы в суспензии «истощенных» клеток, но пр и добавлении аликвоты внеклеточного АТФ явление термоскачка со хр анилось. Величина его была существенно выше, чем у свежеприготовленных эр итр оцитов, и со ставляла 0,0904°С. П р и этом продолжительность термоскачка сокращалась вдвое и со ставляла всего 30 с. П р и помещении свежеотмытых эр итр оцитов в физиологический раствор с добавлением в него ЭДТА (1 мМ) не наблюдали как прироста температуры в ячейке, так и термоскачка (рис. 3).
П р оцесс теплопр одукции суспензий эр итр о -цитов скор пены, котор ый мы обнаружили с помощью термодатчика, с большой степенью вероятности связан с экзотермическими реакциями, в р езультате котор ых пр оисходит выделение тепла. С учетом того, что на протяжении опыта клетки не гемолизировались и подобное выделение тепла не могло происхо-дить за счет обменных пр оцессов внутр и эр ит-р оцитов скор пены, можно пр едполагать уча стие в этом пр оцессе мощной поверхностной экто -
АНАЛИЗ ТЕПЛОВЫ X ЯВЛЕНИЙ В ЭPИТP ОЦИТАX CКОPПЕНЫ 1099
Р ис. 2. Теp могp амма «истощенные» cуcпензий эp итp оцитов.
29.52 29.48
29.44
О
° 90 40
Н
29.28
29.24 -
29.201.....................................
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Время, ч
Р ис. 3. Теp мо^ амма cуcпензии эp итp оцитов, помещенные в cp еду c добавлением ЭДТА (1 мМ).
АТФазы. В пользу такой гипотезы свидетель-cтвуют также данные по пp екp ащению пp иp о cта темпеp атуp ы в пp иcутcтвии ингибитоp а АТФаз - ЭДТА, котоpый не пpоходит чеpез плазматическую мембp ану эp итp оцита.
Ранее нами было показано, что мембpаны эp итp оцитов cкоp пены cодеp жат пул экто-АТФ -азы [1]. Активность этой экто-АТФазы была очень высокой и со ставляла пp и 25°С от 6 до 12 мМоль АТФ /мин/мл плотно упакованных эp итp оцитов. Наличие такой мощной экто -АТФазы могло бы обеспечить обнаpуженный пp оцесс теплопp одукции ^ и условии, что эp ит-p оциты стабильно выделяют до статочное ко-
личество АТФ на повеpxность эпитpоцитов. Как было указано выше, в пользу этой точки зpения свидетельствуют как высокое внутpи-клеточное cодеp жание АТФ в эp итp оцитах p ыб (по p ядка нескольких мМ [2,3]), так и показанная pанее се^еция АТФ эpитpоцитами [4]. Полученные данные также свидетельствуют о том, что выделенные и отмытые эp итp оциты cкоp-пены поставляют во внеклеточное пp о cтp анство АТФ. Следует отметить, что се^еция АТФ эp итp оцитами позвоночных возp а стает пp и воз-pастании темпеpатуpы, усиления сдвигового стр есса и увеличения механической дефо p мации [6]. Все наши экcпеp именты пp о ходили пp и тем-
пературе 26,2-26,8°С, которая для этого вида рыб является близкой к пр едельно допустимому максимуму. Содер жание клеток при этой температуре могло вызывать стойкое выделение АТФ эритроцитами из их внутриклеточного пула.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что обнаружено новое явление, которое трудно было предсказать. Целесообразность проведения этих исследований связана с гипотезой о возможном участии поверхностных эк-то-АТФаз в механизмах, обеспечивающих так называемые «неньютоновские» свойства крови, когда относительная вязкость кр ови уменьша -ется с уменьшением про света со судов, обеспечивая более свободное ее про хождение, достигая максимума эффективности в капиллярном отделе кровотока [7]. Можно предположить, что за счет внеклеточного АТФ и работы поверхностных АТФаз в результате локального разогрева мембраны происходит изменение деформационных характеристик мембран крупных ядерных эритроцитов и приобретение ими определенной гидродинамически выгодной формы, которая обеспечивает эффективное движение клеток, особенно в самом труднопро хо -димом капиллярном отделе кр овотока. Нельзя исключать того, что за счет внеклеточного АТФ и совместной работы экто-АТФаз эндотелия и эритроцитов происходит разогрев пристеноч-
ного слоя плазмы, ведущей к локальному понижению вязкости. Это могло бы обеспечить облегченное прохождение клеток в микро сосудах, где их движение, учитывая размеры клеток и остаточное давление, должно было вызывать большие затруднения.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами in vitro были получены данные, подтверждающие предположения о те-плопродукционной способности суспензий эритроцитов скорпены. Полученные результаты являются серьезным аргументом в пользу выдвинутой гипотезы и открывают перспективу нового направления исследований.
СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Y
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.