ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 10, с. 1263-1268
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.216.32:582.572.4.
АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНА 5.8S рРНК У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ТРЕТЬЕЙ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ГРУППЫ РОДА Allium
© 2014 г. М. А. Филюшин, Е. З. Кочиева
Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 e-mail: michel7753@mail.ru, ekochieva@yandex.ru Поступила в редакцию 02.04.2014 г.
Приводятся результаты анализа вариабельности последовательности гена 5.8S рРНК у 67 представителей подрода Allium и шести других подродов, входящих в третью эволюционную группу рода Allium, выделенную Friesen et al. (2006). Впервые идентифицированы и изучены нуклеотидные замены в последовательности гена 5.8S рРНК у взятых в анализ образцов рода Allium, построена вероятная вторичная структура 5.8S рРНК и показано, что у представителей рода Allium возникающие мутации в гене 5.8S рРНК не затрагивают консервативные мотивы и не оказывают существенного влияния на вторичную структуру молекулы РНК.
DOI: 10.7868/S0016675814090057
У всех высших растений гены рибосомных РНК (кроме гена 58) в ядерном геноме представляют собой тандемно повторяющийся сотни и тысячи раз цистрон 188-ГГ81-5.88-ГГ82-268 [1]. Копии цистрона могут локализоваться на нескольких, зачастую негомологичных, хромосомах и в пределах одного вида цистронные последовательности, как правило, инвариабельны. Подобная однородность последовательностей достигается согласованной эволюцией, что, как считается, является результатом действия механизмов генной конверсии и неравного кроссинговера [2]. Однако у разных видов последовательность цистрона может быть вариабельна, что часто используется для молекулярно-филогенетического анализа различных родов растений [3, 4]. В то же время у отдельных групп растений, как голосеменных, так и покрытосеменных, в геноме идентифицировано несколько типов последовательностей цистрона, при этом в некоторых копиях последовательности накапливаются мутации, дестабилизирующие вторичную структуру молекул рРНК и межгенных спейсеров, что может приводить к образованию псевдогенов [5, 6].
Рибосомные РНК образуют специфические вторичные структуры, с которыми ассоциируются рибосомные белки. Образующиеся трехмерные рибопротеиновые комплексы имеют большое значение в процессе правильной сборки рибосом и последующей трансляции. Вторичная структура гена 5.88 рРНК состоит из четырех петель — 1а, 1Ь, 2 и 3 [7] или, если считать основу петель 1а и 1Ь за отдельную петлю, пяти петель (В4, В5, В6, В7 и В8) [8] и содержит три консервативных мотива [9]. Петля 1Ь (В6) включает присущий всем высшим растениям высококонсервативный
14-нуклеотидный мотив 5'-GAAUUGCA-GAAUCC-3', с которым связывается рибосомный белок при сборке большой субъединицы рибосомы, а также еще два мотива, необходимых для поддержания правильной вторичной структуры молекулы 5.8S РНК [9, 10].
Род Allium является крупнейшим родом семейства Amaryllidaceae (порядок Asparagales) и насчитывает более 800 видов многолетних растений с подземными органами запасания — луковицами и корневищами. Ранее Friesen et al. [11] систематизировали род Allium и выделили 15 подродов, разбив их на три эволюционные группы. Третья эволюционная группа включает в себя семь подродов (Allium, Cepa, Rhizirideum, Butomissa, Polyprason, Cyathophora и Reticulatobulbosa), состоящих из 37 секций. Подрод Allium, объединяющий 15 секций, является самым многочисленным из них и включает такие наиболее значимые в хозяйственном отношении виды, как чеснок A. sativum, лук порей A. porrum, садоводческие формы A. ampelo-prasum (жемчужный, египетский и клубневой луки) и некоторые другие виды.
Целью данной работы стал анализ последовательности гена 5.8S рРНК и изучение возможного влияния нуклеотидных замен на топологию вторичной структуры этой молекулы РНК у представителей семи подродов, входящих в третью эволюционную группу, в особенности у представителей крупнейшей и наиболее значимой с хозяйственной точки зрения секции Allium подрода Allium.
Для анализа последовательности гена 5.8S рРНК была сформирована ДНК-коллекция образцов, представляющих различные подроды рода Allium (таблица). В качестве внешней группы
Растительный материал рода Allium, взятый в анализ
№ п/п Вид № по кат./ сорт Страна происхождения
1 A. ampeloprasum 03-27-0001-80* Франция
2 » 03-41-0041-10* Греция
3 » 03-43-0193-10*» »
4 » 05-13-0026-20* Турция
5 » 08-37-0006-20* Германия
6 » 10-10-0102-20* Турция
7 » 10-10-0103-20* »
8 » 1023* Грузия
9 » 1744* »
10 » 3605* Тунис
11 A. atroviolaceum 2319* Болгария
12 » 2520* Узбекистан
13 » 5966* Турция
14 » 6399* Иран
15 » 6411* Грузия
16 A. baeticum 5646* Великобритания
17 A. commutatum 1662* Франция
18 A. erubescens 6231* Иран
19 » 6234* »
20 A. iranicum 3966* »
21 » 3969* »
22 » 6384* »
23 A. leucanthum 6413* Грузия
24 » 6580* »
25 » 6810* Армения
26 » 6827* »
27 A. longicuspis 04-34-0065-20* Киргизия
28 A. polyantum 5628* Франция
29 A. porrum Сорт Премьер*** Россия
30 » Сорт Сегун*** »
31 A. pseudoampeloprasum 5975* Турция
32 A. pyrenaicum 1248* Франция
33 » 3018* Испания
34 A. rotundum 09-41-0011-20* Грузия
35 » 2197* Болгария
36 » 5298* Турция
37 » 6095* Армения
38 » 6414* Грузия
39 A. sativum 05-29-0001-20* Австрия
40 » 26* Монголия
41 » 39** Россия
42 » 53** Китай
43 » 74** Киргизия
44 » 94** Армения
Подрод/Секция
Allium/Allium
АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНА 5.8S рРНК 1265
Таблица. Окончание
№ п/п Вид № по кат./ сорт Страна происхождения Подрод/Секция
45 » 96** Туркмения
46 » 111** Перу
47 » 178** Туркмения
48 » 208** Ямайка
49 » 242** Бенин
50 » 255** Мексика
51 A. scorodoprasum 963* Германия
52 » 2195* Болгария
53 » 2290* »
54 » 5832* Дания
55 » Жемчуг*** Россия
56 A. tuncelianum 05-13-0020-20* Турция
57 » 09-24-0001-20* »
58 A. cepa Каскад*** Россия Cepa/Cepa
59 A. nutans Лидер*** » Rhizirideum /Rhizirideum
60 A. obliquum 2092*** » Polyprason/Oreiprason
61 A. odorum Априор*** » Butomissa /Butomissa
* Коллекция Ботанического сада Университета Osnabrück (Германия). ** Коллекция ВИР им. Н.И. Вавилова (СПб.). *** Коллекция ВНИИССОК.
были использованы представители других родов порядка Asparagales: Amaryllis beladonna, Narcissus pseudonarcissus (сем. Amaryllidaceae) и Asparagus of-ficinalis (сем. Asparagaceae). Растительный материал был предоставлен Ботаническим садом Университета Osnabrück (Германия), ВНИИССОК (пос. Лесной городок, МО), геолокальные образцы чеснока были предоставлены ВИР им. Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург). Тотальную ДНК выделяли стандартным методом из проростков и гербарного материала [3].
Для амплификации последовательности ITS1-5.8S-ITS2 методом ПЦР были использованы праймеры ITS4 и ITS5 [3]. Нуклеотидные последовательности получены с помощью системы Bigdye (Applied Biosystems) на ABI PRIS M 310 (ЦКП Центр "Биоинженерия" РАН). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы MEGA 5.0. Вероятная вторичная структура молекулы 5.8S рРНК была построена с помощью программы mFold (http://mfold.rit.alba-ny.edu/). Для анализа вторичной структуры молекулы 5.8S рРНК были использованы также секве-нированные ранее [11] последовательности этого гена у представителей 10 секций, относящихся к подроду Allium: A. brevidens sect. Brevidentia (AJ412721.1), A. crystallinum sect. Crystallina
(AJ412724.1) (AJ412718.1) (AJ412719.1) (AJ412732.1) (AJ411903.1) (FJ664286.1)
A. turkestanicum sect. Mediasia
A. umbilicatum sect. Avulsea
A. margaritae sect. Brevispatha
A. caeruleum sect. Caerulea
A. oleraceum sect. Codonoprasum , A. parvulum sect. Minuta (AJ412720.1), A. pallasii sect. Pallasia (GQ181077.1) и A. eremopra-sum sect. Kopetdagia (AJ412726.1), а также представители подрода Cyathophora (A. kingdonii AJ250286.1) и подрода Reticulatobulbosa (A. ubsicol-um AJ411960.1).
Последовательность ITS1-5.8S-ITS2 была ам-плифицирована и секвенирована у 57 образцов секции Allium подрода Allium и четырех образцов, относящихся к другим подродам рода Allium, а также у трех образцов других родов, взятых в качестве внешней группы (таблица). Были установлены границы спейсеров ITS1, ITS2 и гена 5.8S рРНК.
Последовательность гена 5.8S рРНК у всех образцов, взятых в анализ, составила 164 пн, GC-со-став варьировал от 49 до 52.6%, что в целом соответствует полученным ранее данным для различных групп растений [6, 10, 12]. Было выявлено 36 вариабельных сайтов, из которых 26 парсимони-информативных.
лЧ
1b
к Л,
ААч
80
мотив 2
А
\U94 A. odorum
A. caeruleum A. eremoprasum A. obliquumQ
A. ubsicolum U129
A. eremoprasum
|Ci3i
■"■j A. turkestanicum
A70 >
A. turkestanicum
-vv
3
. 100
60
/^^G-C-G-A-ti
A. margaritae
U-
мотив 3
120
2
мотив 1
U145 A. nutans
U122 A141
A. turkestanicum A. umbilicatum A. margaritae A. caeruleum
A. oleraceum A. parvulum A. pallasii A. eremoprasum
A. odorum A. cepa A. obliquum A. ubsicolum
A. caeruleum
3 A. oleraceum C13 A. pallasii A. turkestanicum U137 A. cepa A. obliquum A. nutans
*~"A. kingdolii G141 ■ ■ f
. f
A. brevidens A. crystallinum A. eremoprasum A. kingdolii A. caeruleum
3'
U157 160 I
C164 '
A. turkestanicum
C151 / A. turkestanicum A. caeruleum
A. odorum -A-rkingdolii
A. oleraceum A. pallasii A. eremoprasum
A. odorum A. nutans A. cepa A. obliquum A. ubsicolum
"A. oTeraceum A. pallasii
-О-О-0-Э-О-О -э -o-< -a -=>-<-« -(3-D
26S рРНК
A. caeruleum A. eremoprasum к
AA12 A. caeruleum
A2/
A. turkestanicum
Вторичная структура молекулы 5.8S рРНК у исследуемых образцов рода Allium.
C
Межвидовой полиморфизм гена 5.8S рРНК у анализируемых образцов рода Allium характеризовался большим числом вариабельных сайтов относительно последовательностей этого гена у видов Amaryllis beladonna, Narcissuspseudonarcissus (сем. Amaryllidaceae) и Asparagus officinalis (сем. As-paragaceae). Количество полиморфных сайтов у представителей секций подрода Allium было выше, чем между представителями других исследованных подродов рода Allium. Так, внутри секции Allium были идентифицированы нуклеотидные замены: у двух образцов из десяти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.