научная статья по теме АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕРАГЕРЦЕВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С МЕМБРАНОЙ НЕЙРОНА Физика

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕРАГЕРЦЕВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С МЕМБРАНОЙ НЕЙРОНА»

ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СИНХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2015, № 9, с. 5-8

УДК 537.86.029.65.79+612.822.3.5+577.359

АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕРАГЕРЦЕВОГО (СУБМИЛЛИМЕТРОВОГО) ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

С МЕМБРАНОЙ НЕЙРОНА © 2015 г. Т. А. Запара, С. П. Трескова, А. С. Ратушняк*

Конструкторско-технологический институт вычислительной техники СО РАН,

630090 Новосибирск, Россия *E-mail: ratush@mail.ru Поступила в редакцию 25.12.2014 г.

Установлено, что излучение с длиной волны 130 мкм создает условия для проникновения в клетки витальных красителей, не пересекающих неповрежденную поверхность клетки — плазматическую мембрану. Возможно, повреждающие эффекты обусловлены действием на мембрану активированных кислородных метаболитов, которые могут возникнуть в результате лазерного излучения. Для проверки этих предположений в солевой раствор, окружающий нейроны, перед облучением лазером кроме красителя (люцифера желтого), не проникающего через интактные мембраны, вводили антиоксиданты. Обнаружено, что фенольный антиоксидант гистохром значительно снижает проникновение в клетку красителя. Снижение уровня проникновения в нейроны красителей позволило предположить, что, в условиях воздействия излучения, в субмиллиметровом диапазоне образующиеся в клеточной мембране гидрофильные поры возникают в результате свободнорадикальных процессов, блокируемых антиоксидантами. Установлено, что терагерцевое (субмиллиметровое) излучение может вызвать обратимые нарушения барьерных свойств мембраны и служить индуктором направленной доставки в клетки биологически активных соединений, а антиоксиданты могут являться модуляторами этого процесса и служить защитой от неблагоприятного действия электромагнитных волн в этом диапазоне.

Ключевые слова: лазер на свободных электронах, терагерцевое излучение, нейрон in vitro, клеточная поверхность, свободнорадикальные реакции, антиоксиданты.

DOI: 10.7868/S020735281509019X

ВВЕДЕНИЕ

Перспективы использования ТГц-излучения делают актуальными фундаментальные задачи выявления механизмов действия излучения в этом диапазоне волн на биологические объекты. В рамках этой задачи представляется важным изучение влияния такого излучения на барьерные свойства клеточных мембран. Подобные исследования представляют как теоретический, так и практический интерес. Значение целостности внешней поверхности (мембраны) и функционирования трансмембранных белков в осуществлении живой клеткой своих базовых функций чрезвычайно велико. Ранее было обнаружено [1], что излучение на длине волны 130 мкм вызывает обратимые нарушения целостности мембраны нейронов. Целью данной работы была проверка предположения, что повреждения поверхности клетки обусловлены действием активированных кислородных метаболитов, которые могут возникнуть в результате лазерного излучения в субмиллиметровом диапазоне.

МЕТОДЫ

Работа проведена на изолированных культивируемых вне организма нейронах моллюска Lymnaea stagnalis. Для получения изолированных нейронов использовали методику, сочетающую ферментативную обработку (Protease type XIV, Sigma, USA) окологлоточных ганглиев с последующей механической дефрагментацией клеточных агрегатов. Культивирование осуществлялось в физиологическом растворе следующего состава (мМ): NaCl (55), KCl (1.6), CaCl2 (4), MgCl2 (1.5), NaHCO3 (10) с pH 7.6—7.8 без добавок аминокислот при температуре 6—10°С, в специальных ячейках на пластиковой подложке, прозрачной для волн исследуемого диапазона. Число нейронов в ячейке было в среднем 230 ± 40 клеток. Воздействие терагерцевыми волнами проводили в этих же ячейках объемом 0.5—1 мл при температуре 20—24°С. Температуру регистрировали инфракрасным пирометром DT-8861 с точностью 0.1°С.

Исследовали влияние лазера на свободных электронах терагерцевого диапазона ЦКП Си-

Содержание нейронов, %

100

80

60

40

20

*

*

Процентное содержание нейронов Ьутпава stagnalis с образовавшимися в поверхностной мембране под действием терагерцевого (субмиллиметрового) лазерного излучения гидрофильными порами, выявляемое витальными красителями. По оси ординат отложен процент клеток с проникшим красителем от общего количества исследованных; по оси абсцисс — клетки с люцифером желтым в среде, которые не подвергались лазерному облучению (1), и клетки в среде, подвергнутые терагерцевому облучению: 2 — с трипано-вым синим; 3 — с люцифером желтым; 4 — с люцифером желтым и гистохромом. Использовано излучение терагерцевого диапазона лазера на свободных электронах ЦКП Сибирского центра синхротронного и терагерцевого излучения придлине волны 130 мкм и средней мощности 10 мВт/см2, *р < 0.01 по сравнению с группой клеток, не облученных лазером.

бирского центра синхротронного и терагерцевого излучения, генерирующего импульсы с частотой повторения 4.6—11.2 мГц, длительность импульса от 30 до 100 пс. В экспериментах использовали длину волны 130 мкм при средней мощности от 0.5 до 20 мВт/см2 и экспозиции 30 с. Величину мощности регулировали перемещением ячейки относительно отражателя со сферической поверхностью, находящегося в луче лазера, и определяли измерителем средней мощности ИМО-3 в плоскости объекта.

Функциональное состояние электровозбудимых клеток оценивали по мембранному потенциалу нейронов [2]. Регистрацию проводили по стандартной методике внутриклеточного отведения. Сигнал усиливался, преобразовывался с помощью аналого-цифрового преобразователя (L-CARD) и фиксировался вычислительным комплексом.

Целостность мембраны и жизнеспособность клеток определяли с помощью флуоресцентных

красителей: люцифера желтого (Lucifer Yellow CH) (0.5 мг/мл), BCECF-AM (Invitrogen) [3] и трипа-нового синего (Trypan Blue) (2 мг/мл). Феноль-ный антиоксидант гистохром (2,3,5,6,8-пентагид-рокси-7-этил-1,4-нафтохинон), (Фереин) использовался в концентрации 0.15 мкМ.

Усредненные результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий между группами нейронов оценивались по критерию U (Манна—Уитни).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Добавление в раствор ячейки с клетками три-панового синего позволяло определить процент поврежденных нейронов. Интенсивную голубую окраску приобретали клетки с признаками нарушения морфологии (менее интенсивная окраска эндогенными желто-коричневыми пигментами), они не превышали 2% от общего числа нейронов в ячейке. После воздействия на ячейки лазерным излучением с длиной волны 130 мкм при средней мощности 10 мВт/см2 обнаружили, что содержание интенсивно окрашенных голубых нейронов не увеличивалось. Однако обнаруживались 28 ± 3% клеток (рисунок, диаграмма 2) без морфологических признаков повреждения, но с другим характером окраски трипановым синим. Эти клетки имели небольшие зоны сине-голубой окраски.

Таким образом, используемые параметры лазерного излучения не приводили к гибели клеток, однако вызывали повреждения целостности мембраны, достаточные для проникновения в клетку трипанового синего. Вторую серию экспериментов провели с флуоресцентным красителем, имеющим более высокий квантовый выход — люцифером желтым.

За 10—20 мин до облучения в физиологический раствор, в котором находились клетки, добавляли люцифер желтый. В другие ячейки с клетками в физиологический раствор добавляли люцифер желтый и гистохром.

Воздействовали на ячейки лазерным излучением с длиной волны 130 мкм при средней мощности 10 мВт/см2, кроме контрольных ячеек, содержащих только люцифер желтый. Через 40 мин после облучения многократно промывали клетки физиологическим раствором во всех ячейках.

Обнаружили, что воздействие лазерного излучения в ячейках с люцифером желтым приводит к появлению равномерно окрашенных флуоресцирующих нейронов в 87±4% случаев (рисунок, диаграмма 3). Так как этот краситель может проникать в клетки только через повреждения, поры в мембране, то можно предположить, что нарушение целостности мембраны инициируется облучением на данной длине волны.

0

3

4

АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ

7

В ячейках, в которые кроме люцифера желтого был введен гистохром, равномерно окрашенные флуоресцирующие клетки не были обнаружены. В некоторых клетках (6 ± 2%) наблюдались единичные точечные зоны флуоресценции (рисунок, диаграмма 4). Эти данные позволяют предположить, что действие антиоксиданта блокирует образование и развитие гидрофильных пор в мембране, вызванное действием лазерного излучения.

В контрольных ячейках с люцифером желтым, не подвергнутых воздействию лазерного излучения, не были обнаружены флуоресцирующие клетки (рисунок, диаграмма 1).

Для выявления характера повреждения клеток проводили обработку трипановым синим сразу после проведения исследований методом флуоресцентной микроскопии. Обнаружили, что окрашивались только единичные клетки, у которых очевидные признаки разрушения внешней мембраны были обнаружены до облучения клеток. Основная масса клеток, демонстрировавших флуоресценцию люцифера желтого и облученных с гистохромом, не окрашивалась трипановым синим. Эти данные свидетельствуют о том, что повреждающий эффект излучения с длиной волны 130 мкм является обратимым, не фатальным для нейронов.

Проверка жизнеспособности клеток была проведена также с использованием красителя BCECF-AM. Краситель может проникать через неповрежденную плазматическую мембрану и под действием внутриклеточных эстераз преобразоваться во флуоресцентную форму ВСЕСЕ Была обнаружена флуоресценция клеток, в которые проник люцифер желтый. Это свидетельствует о том, что целостность мембраны нейронов восстанавливается после повреждения, вызванного воздействием излучения с длиной волны 130 мкм.

Через час после облучения проводили внутриклеточную микроэлектродную регистрацию мембранного потенциала нейронов. Было обнаружено, что нервные клетки, облученные лазером с длиной волны 130 мкм, имеют нормальные для электровозбудимых клеток значения отрицательного мембранного потенциала (порядка -60, -70 мВ).

Гистохром является медицинским препаратом природного эхинохрома А. Было выявлено анти-оксидантное действие гистохрома при торможении окисления липосом, индуцированного аскор-батом жел

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Физика»