БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2014, № 1, с. 29-37
^ ВОДНАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.8(479.24-285.2)
АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ДВУХ КАРСТОВЫХ ОЗЕР ЛИТВЫ © 2014 г. А. Кревш*, А. Кучинскене*, **, Н. Куйсене***
*Центр исследований природы, LT-08406 Вильнюс, ул. Жалюю эжяру, 47, Литва, e-mail: alinakrevs@gmail.com **Литовский эдукологический университет, LT-08106Вильнюс, ул. Студенту, 39, Литва ***Вильнюсский университет, LT-03101 Вильнюс, ул. М.К. Чюрлёне, 21/27, Литва Поступила в редакцию 16.07.2012 г.
Изучено пространственное распределение и состав аноксигенных фототрофных бактерий в накопительной культуре бактериального сообщества из разных глубин карстовых озер Киркилай и Рамуне-лис с использованием спектрометрического анализа, микробиологических и молекулярных методов. В оз. Киркилай наиболее высокая общая численность бактерий определена в металимнионе и у дна (до 10.7 х 106 кл./мл), в оз. Рамунелис — в анаэробном гиполимнионе (до 22.4 х 106 кл./мл). Повышенная минерализация водной среды (0.5—1.2 г/л) с доминированием ионов SO4 и Ca2+ создавали
благоприятные условия для развития сульфатредуцирующих бактерий, выделяющийся в результате их жизнедеятельности сероводород способствовал развитию сероокисляющих бактерий. Пигментный анализ фототрофных зеленых и пурпурных бактерий показал, что в накопительных культурах доминировали зеленые серобактерии. По данным филогенетического анализа, в накопительной культуре зеленых серобактерий доминировал вид Chlorobium limicola, пурпурных — несерные пурпурные бактерии рода Rhodopseudomonas.
Ключевые слова: водоемы гипсового карста, фототрофные бактерии, филогенетический анализ, Chlorobium limicola, Rhodopseudomonas sp.
DOI: 10.7868/S0320965214010082
ВВЕДЕНИЕ
Экологические условия в карстовых озерах сульфатного типа благоприятствуют развитию микроорганизмов, участвующих в цикле серы. В этих экосистемах редукция сульфатов — основной процесс анаэробного дыхания [10, 17]. В бескислородном гиполимнионе наблюдается накопление конечного продукта сульфатредукции — сероводорода. Свет и сульфиды — важнейшие факторы, обусловливающие развитие и пространственное распределение аноксигенных фо-тотрофных бактерий, которые играют существенную роль в биогеохимическом цикле серы [1, 9, 10, 19]. Исследования последних лет показали значительное генетическое разнообразие фо-тотрофных аноксигенных бактерий и гетерогенность их вертикального распределения в некоторых богатых сульфидами озерах [3, 6, 7, 29].
В северной части Литвы находится карстовый регион, площадь которого 500—1000 км2. Активные карстовые явления, возникающие в результате выщелачивания гипсовых и доломитных по-
род, приводят к образованию провальных ям, которые впоследствии превращаются в небольшие (0.001—0.04 км2) водоемы, имеющие прямое соединение с подземными водами [13]. Поскольку гипсовый слой достигает дна таких озер, в донных
осадках и воде доминируют ионы Са2+ и 80^ концентрация которых достигает 0.6 и 1.4 г/л соответственно [27]. Озера гипсового карста с сульфатным типом воды очень редки не только в Литве, но и во всей Европе. Высокие концентрации сульфатов в донных осадках и в водной толще карстовых озер Литвы в присутствии органических веществ создают благоприятные условия для развития сульфатредуцирующих бактерий с доминированием БезШ/оу^по ¿езШ/ипсат [21]. Из-за небольших глубин озер солнечный свет достигает сероводородных слоев, способствуя развитию аноксигенных фототрофных бактерий. Массовое развитие пурпурных серобактерий впервые наблюдалось в одном из карстовых озер (оз. Киркилай) в 2001 г. во время летней стратификации. Идентификация этих бактерий с применением
молекулярных методов и использованием микроорганизмов из природного материала (in situ) подтвердила ранее морфологически описанный доминирующий вид Chromatium okenii [32]. Вместе с тем, до сих пор мало информации о распространении и видовом составе аноксигенных фото-трофных бактерий в карстовых озерах Литвы.
Цель работы — исследования пространственного распределения бактерий в двух озерах гипсового карста в летний период, получение накопительных культур аноксигенных фототрофных бактерий и идентифицикация доминирующих видов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили в карстовых озерах Киркилай и Рамунелис, расположенных на севере Литвы (56°14'54'' с.ш., 24°41'15" в.д.). Озеро Киркилай — самый крупный карстовый водоем с площадью ~0.04 км2, средней глубиной 1.07 м, максимальной — 6.3 м. Озеро образовалось в результате слияния ~ 30 разных по возрасту и объему ям в течение последних нескольких сотен лет [27]. Озеро Рамунелис расположено в непосредственной близости и восточнее оз. Киркилай. Площадь озера 0.01 км2, максимальная глубина 5 м. Озеро овальной формы с крутыми и густо поросшими кустарниками и деревьями берегами. Во время весеннего половодья оба озера соединяются.
Пробы воды для химических и микробиологических анализов отбирали по вертикали с интервалом 0.5—1.0 м батометром Руттнера в наиболее глубокой части озер во время летней стратификации в августе 2009 г. Прозрачность измеряли диском Секки, температуру, pH, соленость — in situ с помощью селективных электродов портативного измерителя WTW MultiLine F/Set. Содержание растворенного кислорода определяли по методу Винклера, количество сероводорода — колориметрическим методом с диметил-1.4-фенилен-диамин дихлоридом c помощью визуального измерителя Merc-Microquant, сульфаты — турби-метрическим методом [31].
Общую численность бактерий определяли на темных поликарбонатных мембранных фильтрах c диаметром пор 0.2 мкм (Millipore) флуоресцентным методом с использованием DAPI в качестве красителя [23]. Бактериальные клетки подсчитывали в 20—40 полях зрения микроскопа Olympus IX70 (х1000).
Для культивирования фототрофных серобактерий использовали среду Библа и Пфеннинга [5]. Для получения накопительной культуры фо-тотрофных бактерий 1 мл озерной воды отбирали стерильными шприцами и высевали в герметично закрытые флаконы со средой объемом 64 мл. Об-
разцы для инокуляции брали из разных слоев воды в зависимости от физико-химических условий: с глубины 1.5, 2.0, 4.0 и у дна — в оз. Киркилай, с глубины 1.5, 2.0, 2.5, 4.0 м и у дна — в оз. Рамунелис. Зеленые серные бактерии культивировали при температуре 20°С и естественной освещенности, пурпурные серные бактерии — при температуре 25°С и освещенности 1500 лк [30]. Накопительные культуры зеленых серных бактерий начинали развиваться в течение 3— 4 нед, пурпурных — 5—6 нед. Морфологию клеток анализировали с помощью светового микроскопа Olympus CH 40 при увеличении х1000.
Пигментный анализ фототрофных пурпурных и зеленых серобактерий проводили спектрофото-метрическим методом [12]. Известный объем среды с накопительной культурой фильтровали через мембранные Gf/C ("Gelman Sciences") фильтры с диаметром пор 0.2 мкм. Для экстинкции пигментов фильтры обрабатывали 90%-ным ацетоном в течение 18—20 ч в темноте при температуре 4°С. Спектры поглощения полученных экстрактов снимали на спектрофотометре (Helios у, "Perkin Elmer"). Согласно данным пигментного анализа, отбирали культуры для идентификации их доминирующих видов молекулярными методами.
Для выделения ДНК использовали накопительные культуры бактерий, выращенные в среде для пурпурных серных бактерий после инокуляции водных образцов из придонного слоя оз. Киркилай (1p), а также накопительные культуры бактерий, выращенные в среде для зеленых серных бактерий после инокуляции проб воды из металимниона (2 м) оз. Киркилай (2z) и металим-ниона (2.5 м) оз. Рамунелис (5z). Накопительные культуры фототрофных серобактерий концентрировали центрифугированием (7500 об./мин, 10 мин, 4°C). ДНК выделяли с использованием Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas"), согласно инструкции фирмы-производителя.
Амплификацию генов 16S рРНК проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер ПЦР с (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.25 мкмоль каждого праймера (27F и 1495R) [24], 1.25 U рекомбинантной Та^ДНК по-лимеразы и 10 нг тотальной ДНК. Ампликацию проводили в термальном циклере Eppendorf при следующих условиях: начальная денатурация при температуре 95°C в течение 2 мин, затем 29 циклов, каждый в течение 1 мин при температуре 95°C, при 50°C — в течение 2 мин и при 72°C — в течение 3 мин, конечная денатурация при 72°C — в течение 7 мин. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза. Продукты ПЦР клонировали в вектор pTZ57R/T, используя InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit ("Fermentas"). Клонирование проводили по инструкции фирмы-производителя. Для трансформации ис-
Таблица 1. Физико-химические показатели воды озер Киркилай и Рамунелис в августе 2009 г.
Озеро Глубина, м Температура, °C pH O2 H2S 2 — SO4 Z ионов
мг/л
Киркилай 0 20.2 8.1 7.5 0 291 500
1 20.0 8.1 6.0 0 — 500
1.5 19.0 7.8 2.0 0 — 700
2 18.9 7.7 0 0 — 800
2.5 15.0 7.5 0 0.2 — 1000
3 14.3 7.1 0 0.2 719 1000
4 11.4 7.1 0 1.5 866 1100
5 10.8 7.1 0 1.5 — 1200
6 8.9 7.0 0 4.0 931 1200
Рамунелис 0 19.0 8.1 8.0 0 360 500
1 18.5 8.1 5.0 0 — 500
2 17.4 7.2 1.0 2.7 — 700
2.5 12.4 7.1 0 3.0 — 1000
3 11.0 7.1 0 4.5 — 1000
4 10.0 7.0 0 5.0 — 1100
5 9.2 7.0 0 10.0 1030 1200
Примечание. " — " — не определено.
пользовали штамм Escherichia coli DH5a. Клонированные гены 16S рРНК подвергали рестрикции эндонуклеазами AluI и RsaI с целью отобрать различающиеся клоны 16S рДНК.
Секвенировали клонированные гены 16S рРНК, рестрикционные профили которых доминировали в конкретной накопительной культуре бактерий. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer system ("Applied Biosystems"). Для сборки контигов и оценки сходства секвенированных генов использовали программы MEGALIGN, SEQBUILDER и SEQMAN (LASERGENE 6), для выравнивания нуклеотидных последовательно -стей генов 16S рРНК и филогенетического анализа - программу MEGA 4.0 [25, 28].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Физико-химическая характеристика. В период исследований наблюдали резкое расслоение водных масс по данным физи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.