МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 4, с. 484-499
^^^^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^^
СТАТЬИ
УДК 579.23:26+579.81
АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ТЕРМАЛЬНОГО ИСТОЧНИКА ГОРЯЧИНСК (ПРИБАЙКАЛЬЕ)
© 2014 г. А. М. Калашников*, В. А. Гайсин**, М. В. Сухачева**, Б. Б. Намсараев***, А. Н. Пантелеева**, Е. Н. Нуянзина-Болдарева*, Б. Б. Кузнецов**, В. М. Горленко*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва ***Институт общей и экспериментальной биологии Бурятского научного центра СО РАН, Улан-Удэ
Поступила в редакцию 29.11.2013 г.
В работе было проведено исследование видового состава аноксигенных фототрофных бактерий в микробных матах Горячинского термального источника вдоль температурного градиента. Источник относится к группе азотных щелочных гидротерм, находится на берегу озера Байкал в 188 км к северо-востоку от города Улан-Удэ. Вода источника сульфатно-натриевого типа, содержит следы сульфида, минерализация не превышает 0.64 г/л, рН 9.5. В зоне выхода на поверхность Горячинского источника температура воды достигает 54°С. Идентификацию выделенных культур нитчатых аноксигенных фототрофных бактерий, несерных и серных пурпурных бактерий, а также аэробных аноксигенных фототрофных бактерий проводили с использованием молекулярного маркера ^рм/ЪМ. Для идентификации зеленых серобактерий применяли маркер/тоА. В матах преобладали нитчатые цианобактерии, тогда как аноксигенные фототрофы составляли минорный компонент фототрофных сообществ. Термофильные бактерии СЫого//1ехт ашапйаст идентифицированы в пробах как термофильного, так и мезофильного мата. Из матов, сформированных при высоких (50.6—49.4°С) и низких (45—20°С) температурах, выделены культуры несерных пурпурных бактерий (НПБ), близкие к видам В\а&осЫоп$ш/оутйЫ и Rhodomicrobium уаптеШ. В низкотемпературных матах обнаружены также пурпурные серобактерии родов Л11ос^отайит и Пюсар5а, а также зеленые серобактерии СЫогоЫит 8р. Истинных термофильных пурпурных и зеленых серобактерий в Горячинском источнике не выявлено. Обнаруженные аноксигенные фототрофные бактерии, типичны для сообщества сульфурета, для функционирования которого серный цикл является обязательным. Представляет интерес присутствие в мезофильном альгобактериальном мате (20°С) аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий, идентифицированных как Лgrobacterium (Rhizobium) tumifaciens.
Ключевые слова: Горячинск, район оз. Байкал, гидротермы, аноксигенные фототрофные бактерии, pufLM, fmoA.
DOI: 10.7868/S0026365614040089
Термальные источники привлекают внимание микробиологов, прежде всего, как местообитание термофильных микроорганизмов, принадлежащих к разным физиологическим и таксономическим группам. В ложе источников формируются микробные маты, которые считают аналогами древних фототрофных сообществ [1]. Продуцентами в них являются цианобактерии, одноклеточные водоросли, а также аноксигенные фото-трофные бактерии. В наземных гидротермах температура постепенно меняется от высокой, благоприятной для развития термофильных микроорганизмов, до умеренной. Таким обра-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: vgorlenko@mail.ru).
зом, термальные источники представляют собой природную модель, на которой возможно исследовать переходные этапы формирования микробных сообществ от термофильных к мезо-фильным.
Гидротермы подразделяются на несколько типов [2], среди которых наиболее широко распространены щелочные азотные термы. Большие области Центральной Азии, Восточной Сибири, Индии, Восточной Африки, Южной Африки, Южной Америки, запада США, Европы, западные и восточные районы Исландии (кроме центральных) относятся к провинциям щелочных азотных термальных вод. Геохимический облик
азотных терм определяется процессами гидролитического разложения силикатов и потерей кислорода на окислительные процессы, вследствие чего в их газовом составе преобладает азот, и происходит частичное восстановление сульфатов с образованием гидросульфидных ионов. В области Байкальского рифта изливается большое количество источников с температурой до 84° С и рН от 6.1 до 9.3, относящихся к азотному типу гидротерм. Они формируются вне зависимости от влияния магматических и термо-метаморфиче-ских процессов, что также отличает их от гидротерм областей активного вулканизма [3].
Микробные сообщества гидротерм Байкальской рифтовой зоны исследуются давно, однако определение видового состава фототрофных микроорганизмов проводилось только традиционными микробиологическими методами, без привлечения методов молекулярно-генетической идентификации. Наиболее полно исследованы фототрофные сообщества источников мыса Ко-тельниковского, Большереченского источника (30 км от Северного кордона Баргузинского заповедника) и источника Уро, расположенного в 40 км от поселка Баргузин [4, 5]. Общая гидрохимическая и микробиологическая характеристика гидротерм Байкальской рифтовой зоны приводится в ряде сборников [6]. Горячинский источник известен уже более двухсот лет, но видовой состав его микрофлоры исследован недостаточно полно.
Целью данной работы являлось изучение видового разнообразия аноксигенных фототроф-ных бактерий в микробных матах Горячинского термального источника с использованием как традиционных микробиологических методов, так и методов молекулярной диагностики.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источник выделения — альгобактериальные маты Горячинского источника, сформированные при разных температурах. Температуру в местах отбора проб измеряли с помощью электротермометра (HANNA HI 8314, Румыния), величину рН — с использованием портативного рН-метра (HANNA HI 8314, Румыния), минерализацию воды — кондуктометра TDS-4 (Сингапур). Концентрацию сульфида определяли колориметрически по стандартной методике. Образцы матов и выросшие культуры микроскопировали с помощью светового микроскопа Olympus BX-41 ("Olympus", Япония).
Спектры поглощения клеточных пигментов снимали после разрушения клеток природных образцов и выросших культур в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН Soniprep 150 plus при 14.5 кГц. Разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 7000 g в течение 5 мин. Надосадочную
жидкость, содержащую фрагменты мембран и хло-росомы, использовали для спектрофотометрии.
Таксономическую принадлежность оксигенных фототрофов определяли по морфологическим признакам. Аноксигенные фототрофы учитывались методом посева на элективных средах. Культивирование аноксигенных нитчатых фототроф-ных бактерий (АНФБ) проводили в среде следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0.4; NH4Cl - 0.5; MgCl2 - 0.4; KCl - 0.5; NaCl - 0.5; Na2S2O3 - 0.5; CaCl2 ■ 2H2O - 0.3; NaHCO3 - 0.5, витамин B12 -10 мкг/л, комплекс микроэлементов по Пфенни-гу-Липперту.
Для различных таксономических групп фото-трофных бактерий использовали несколько модификаций указанной среды. Для культивирования термофильных видов Chloroflexus и несерных пурпурных бактерий в среду вносили следующие добавки (г/л): ацетат Na - 0.5, малат Na - 0.5, пи-руват Na - 0.5, дрожжевой экстракт - 0.1 и Na2S ■ ■ 9 H2O - 0.1. При культивировании видов, принадлежащим к семействам Chromatiaceae и Chlorobiaceae, в основную среду вносили (г/л): Na2S ■ 9 H2O - 0.5, тиосульфат Na - 0.5 и ацетат Na - 0.5. Аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии культивировали на агаризованной среде для гете-ротрофов в чашках Петри [7].
При идентификации культур аноксигенных фототрофных бактерий (АФБ) принимали во внимание морфологию клеток, типы бактерио-хлорофиллов и каротиноидов, способность к гетеротрофному и автотрофному росту на сульфиде, способность к аэробному росту в темноте, влияние температуры и рН среды.
Молекулярно-генетическую идентификацию
АФБ проводили в монокультурах с помощью праймеров на группоспецифические молекулярные маркеры pufLM, fmoA. Выделенные чистые культуры аэробных бактериохлорофилл а-содер-жащих бактерий идентифицировали с помощью анализа гена 16S рРНК.
ДНК клеток культур аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) выделяли с помощью CTAB-метода [8] с незначительными модификациями. Из клеток всех остальных культур бактерий ДНК выделяли с помощью описанного ранее метода [9].
Фрагменты участка оперона pufLM амплифи-цировали и секвенировали с использованием двух групп-специфичных праймерных систем. Первая праймерная система, специфичная для несерных и серных пурпурных, была описана в работе [10]. Вторая праймерная система, специфичная для хло-росом-содержащих АНФБ, была сконструирована для проведения данного исследования. Последовательность АНФБ-специфичных праймеров: (прямой) 5'-CGAGCCGGARTAYAAGATCAA-3', (об-
Физико-химические характеристики и видовой состав фототрофных микроорганизмов источника Горячинский
Место отбора проб Температура, °С pH Видовой состав
Гор-1 50.6 8.8 Leptolyngbya sp., Oscillotoria sp., Chloroflexus aurantiacus, Blasrochloris sulfoviridis
Гор-2 49.4 9.0 Leptolyngbya sp., Oscillotoria sp., Chloroflexus aurantiacus, Blasrochloris sulfoviridis, Rhodomicrobium vannielii
Гор-3 45.8 9.0 Leptolyngbya sp., Oscillotoria sp., Chloroflexus aurantiacus, Allochromatium sp., Thiocapsa sp.
Гор-4 25 9.0 Leptolyngbya sp., Oscillotoria sp., Navicula sp., Chloroflexus aurantiacus, Blasrochloris sulfoviridis, Chlorobium sp., Agrobacterium tumifaciens, Rhodopseudomonas faecalis
ратный) 5'-AGAAGATCGAGAGCATGTG-3'. Тем-пературно-временной профиль ПЦР при использовании обеих праймерных систем был следующим: первый цикл — 94°C х 2 мин, 56°C х 30 с, 72°C х 1 мин 30 с; последующие 42 цикла - 94°C х 30 с, 56°C х 30 с, 72°C х 1 мин 30 с; окончательная полимеризация — 72°C х 5 мин.
Дополнительно использовали праймеры, сконструированные нами для детекции гена pufM у Agrobacterium tumifaciens: (прямой) 5'-GCACCTGGACTGGA-3'; (обратный) 5'-CCATG-GTCCAGCGCCAGA-3'. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: 94°C х 3 мин; последующие 30 циклов — 94°C х 50 с, 55°C х 50 с, 72°C х 50 с; окончательная полимеризация — 72°C х 10 мин.
Реакцию амплификации гена 16S рРНК и последующее секвенирование П
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.