МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 90-108
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.262(571.122-285.2)
АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ СТРАТИФИЦИРОВАННОГО ОЗЕРА КИСЛО-СЛАДКОЕ (КАНДАЛАКШСКИЙ ЗАЛИВ БЕЛОГО МОРЯ)
© 2014 г. О. Н. Лунина*, ^ А. С. Саввичев*, Б. Б. Кузнецов**, Н. В. Пименов*, В. М. Горленко*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Центр "Биоинженерии"Российской академии наук, г. Москва
Поступила в редакцию 14.03.2013 г.
В сентябре 2010 г. проведено исследование сообщества аноксигенных фототрофных бактерий (АФБ) водной толщи небольшого стратифицированного озера Кисло-Сладкое, недавно отделившегося от моря (Кандалакшский залив Белого моря). Вода сероводородной зоны озера имела буро-зеленый цвет за счет интенсивного развития зеленых серобактерий (ЗСБ). Из проб воды озера было выделено 9 штаммов АФБ, три из которых отнесены к ЗСБ, 5 — к пурпурным серобактериям (ПСБ) и 1 — к пурпурным несерным бактериям (ПНБ). В фототрофном сообществе хемоклина преобладали ЗСБ. Было неожиданным, что два морфологически разных окрашенных в зеленый цвет штамма ЗСБ оказались филогенетически идентичными и близкими к коричнево-окрашенным бактериям Chlorobiumphaeovibrioides, имея с ними 99% сходства по данным сиквенса гена 16S рРНК. В то же время, с ближайшим зелено-окрашенным видом (Chlorobium luteolum) их сходство составило 98%. Два морфо-физиологически близких штамма ПСБ (7crPS10 и ^mPS10), имели округлые клетки, содержали окенон и газовые вакуоли. Эти штаммы по гену 16S рРНК имели наибольшее родство (99%) с двумя сильно отличающимися друг от друга видами Thiocapsa: Tca. marina (содержит окенон, без газовых вакуолей) и Tca. rosea (содержит спириллоксантин и газовые вакуоли). Остальные выделенные штаммы пурпурных бактерий оказались близкими к уже известным и описанным видам АФБ.
Ключевые слова: полярные экосистемы, Белое море, стратифицированные водоемы, меромиктиче-ские озера, аноксигенные фототрофные бактерии, зеленые серобактерии, пурпурные серобактерии, пурпурные несерные бактерии, филогения аноксигенных фототрофных бактерий, Chlorobium phaeovibrioides, Prosthecochloris sp., Chlorobaculum chlorovibrioides, Thiocapsa marina, Thiocapsa rosea, Thiorhodococcus kakinadensis, Thiorhodococcus drewsii, Rhodovulum sulfidophilum.
DOI: 10.7868/S002636561401008X
Небольшое стратифицированное озеро Кисло-Сладкое (66°55' с.ш., 33°14' в.д.), расположено на берегу Ругозерской губы Кандалакшского залива Белого моря в 2-х километрах к востоку от Беломорской Биологической станции МГУ [1]. Его размеры 100 м х 60 м, средняя глубина 1—1.5 м, максимальная глубина 4.5 м. Озеро образовалось в середине XX века за счет поднятия морского берега. Ранее на этом месте был узкий морской пролив между материком и небольшим островом, с порогами на входе и выходе.
Пополнение озера пресной водой происходит, главным образом, во время таяния снега, небольшой вклад вносят дожди. Сток пресной воды из болота мал (в летнее время 0.01 л/с), приток соленой воды, просачивающейся под камнями порога, в 10 раз больше, чем пресной (1—1.5 л с-1) [1].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: onlun@yandex.ru).
Глубинные слои воды содержат сероводород. Малая глубина озера и наличие хорошо освещенной сероводородной зоны создают благоприятные условия для развития в ней аноксигенных фототрофных бактерий.
Фототрофное сообщество недавно образовавшегося озера представляет собой несомненный интерес. Ранее изучение АФБ в озере Кисло-Сладкое не проводилось, и задачей нашей работы было исследование условий существования анок-сигенных фототрофных бактерий, их выделение и идентификация с использованием микробиологических и молекулярных методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор проб воды производили в котловине озера (4.2 м). Пробы воды отбирали с помощью силиконовой трубки, закрепленной на калибро-
ванном тросе, и портативного медицинского насоса Whale Premium Submersible Pump GP1352 (Ирландия). Общую соленость воды определяли в свежих образцах, используя солемер-кондуктометр HANNA HI 98130 (Германия). Концентрацию кислорода и сероводорода измеряли непосредственно после отбора проб с использованием тест наборов Aquamerck ("Merck", Германия).
Измерение скорости фотосинтеза проводили радиоизотопным методом с использованием 14С-бикарбоната [2]. Для этого в заполненные озерной водой стеклянные флаконы объемом 30 мл вносили 0.2 мл меченого бикарбоната (20 мкКи, 50 мкг экв л-1). В качестве селективного ингибитора оксигенного фотосинтеза использовали диурон в конечной концентрации 7 мМоль л-1 [3]. Склянки вывешивали на капроновом фале на те же горизонты, с которых были отобраны пробы воды. Длительность инкубации составляла 1 сутки. После завершения инкубации пробы воды фиксировали 1 мл разбавленной HCl и фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0.2 мкм. Продукцию оксигенного фотосинтеза рассчитывали по разнице суммарного и аноксигенного (склянка с диуроном) фотосинтеза.
Общую численность микроорганизмов определяли на поликарбонатных мембранных фильтрах с диаметром пор 0.2 мкм флуоресцентным методом с использованием диамидино-4',6'-фе-нил-2-индолдихлоргидрата (ДАФИ) в качестве красителя [4]. Подсчет бактериальных клеток проводили на эпифлуоресцентном микроскопе ("Zeiss", Германия).
Содержание бактериохлорофиллов (Бхл) определяли на мембранных фильтрах с диаметром пор 0.2 мкм, через которые фильтровали 200-400 мл озерной воды. Далее, в лабораторных условиях для экстракции пигментов фильтры обрабатывали ацетон-метаноловой смесью (7 : 2) и снимали спектры поглощения полученных экстрактов на спектрофотометре Cary-100 ("Varian", Австралия) в диапазоне длин волн 350-900 нм. Для определения содержания пигментов мы ориентировались на формулы [5]:
С(мкг Бхл (d + e)) = (1.315 х E651 -
- 0.643 х E663 + 0.005) v х 106/(Vх d х s х Бхлd),
С (мкг Хл а) = (1.35 х Е663 -
- 0.643 х Е651 + 0.005) v х 106/(Vх d х s х Хла),
где С (мкг Бхл (d + e)) - концентрация бактериохлорофиллов d + e (мг м-3), E651, E663 - светопо-глощение ацетонового экстракта пигментов при длине волны 651 и 663 нм (исключая мутность, измеренную при E850), v - объем ацетонового экстракта (мл), V - объем профильтрованной пробы озерной воды (мл), d - ширина кюветы (см),
s — абсорбционный коэффициент: еБхл d = = 98.0 мг см-1 [6], sХл а = 84.0 л г-1 см-1 [7]. Однако, в отличие от авторов вышеназванной статьи, для экстракции пигментов нами был использован не чистый ацетон, а смесь ацетона и метанола. В результате этого на спектрах наблюдалось смещение пиков поглощения света на 4 нм в длинноволновую область. Поэтому в расчетах вместо E651 мы брали значение Е655, а вместо Е663 — Е667:
С(мкг Бхл^ + e)) = (1.315 х E655 -
- 0.643 х E667 + 0.005) v х 106/(Fх d х s х Бхлd),
С(мкг Хл а) = (1.35 х Е667 -
- 0.643 х Е655 + 0.005) v х 106/(Fх d х s х Хл а).
Для получения накопительных культур АФБ в полевых условиях свежеотобранную озерную воду с глубин 2, 2.7, 2.9, 3.1 и 4.2 м наливали в стерильные пенициллиновые флаконы, добавляли 1-2 капли 10% дрожжевого экстракта. Для подавления оксигенного фотосинтеза в каждый флакон вносили порошок диурона на кончике шпателя. Флаконы герметично закрывали пенициллиновой пробкой, оставляя пузырек воздуха, размером с горошину.
Также, для получения накопительных культур пробы озерной воды объемом 5 мл (с глубин 2, 2.7, 2.9, 3.1 и 4.2 м) высевали с помощью стерильных шприцов в герметично закрытые стеклянные пенициллиновые флаконы со средой объемом 30 мл. Использовали среду (с несколькими вариантами солености по NaCl) следующего состава (на 1 л дистиллированной воды): КН2РО4 - 0.7 г; Na-Cl - 5, 10, 15, 20 или 25 г; MgSO4 • 7Н2О - 0.5 г; NH4Cl - 0.7 г; KCl - 0.33 г; NaHCO3 - 0.15 г; CaCl2- 0.1 г; Na2S2O3 • 5H2O - 1 г; Na2S • 9Н2О -0.5 г; Na-ацетат - 0.5 г; Na-пируват - 0.5 г; дрожжевой экстракт - 0.1 г; раствор микроэлементов -1 мл [8]; витамин В12 - 20 мкг, порошок диурона, рН среды 7.5-8.
Для определения относительной численности АФБ в лабораторных условиях был произведен посев проб воды, из тех же горизонтов методом предельных серийных разведений природного материала на агаризованную (0.5% агара) питательную среду (15 г л-1 NaCl). Культивирование проводили анаэробно в течение месяца в люми-ностате при освещенности 2000 и температуре 20-25°C. Выделение и очистка культур достигались методом предельных разведений посевного материала с использованием жидких и агаризо-ванных сред с разной соленостью. В среду для зеленых серобактерий добавляли комплекс витаминов [8].
Для первичной идентификации микроорганизмов использовали такие признаки как форма и размер клеток и микроколоний, цвет отдельных колоний фототрофных бактерий, наличие газо-
Глубина, м
O2 (мг л 1), H2S (мг л 1), pH, T(°C), общая соленость (г л
Рис. 1. Гидрохимические показатели воды оз. Кисло-
Сладкое, сентябрь 2010 г.
вых вакуолей, образование и способ отложения капель серы, а также спектр поглощения суспензии целых клеток чистой культуры в 50% глицерине и в ацетон-метаноловом экстракте (7 : 2).
Пигментный состав полученных культур АФБ исследовали в препаратах целых клеток в 50% глицерине и в ацетон-метаноловых (7 : 2) экстрактах. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре Cary 100 ("Varian", США) в диапазоне длин волн 350—900 нм.
Микрофотографии клеток получали с помощью светового микроскопа Olympus при увеличении 1200 (объектив 90х) с иммерсионной системой и фазовым контрастом.
Для получения ультратонких срезов бактерий, исследуемый материал фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилат-ном буфере (рН 7.2) при 4°C в течение 2 ч; трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1% растворе OsO4 в 0.05 М какоди-латном буфере (рН 7.2) в течение ночи при 4°C. После обезвоживания в серии спиртов материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин 3% раствором уранилацетата в 70% спирте и дополнительно цитратом свинца [9].
Для получения негативно окрашенных препара
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.