IMMUNE STATUS OF PEOPLE OF REPRODUCTIVE AGE WITH UROGENITAL BACTERIAL INFLAMMATORY PATHOLOGY
OF VARIOUS ETIOLOGIES
Zherebyateva O. O.1, Mikhailova E. A.1, Papin A. G.2, Voroninа L. G.1, Setko N. P.1, Mahalova G. O.1
'Orenburg State Medical Academy of the Ministry of Health of Russia; 2Orenburg Regional Dermatovenerologic Dispensary Russian Ministry of Health, Orenburg, Russia
The presence of characteristic features of parameters of systemic immunity at gonococcal and nonspecific uretroprostatitis and diagnostic value of these indicators is discussed.
Key words: immunity, gonococcai, infection
АНТИ-ВИЧ-АКТИВНОСТЬ ОГРАНИЧЕННО ДЕПОЛИМЕРИЗОВАННОГО АЗОТИСТОЙ КИСЛОТОЙ ХЛОРИДА ХИТОЗОНИЯ
Жернов Ю.В.1,2, Кривцов Г. Г.3, Корнилаева Г. В.1, Карамов Э.В.1,2
ФГБУ «НИИвирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России; 2ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; 3ФГБУ «НИИвакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
В данной работе представлены результаты исследования анти-ВИЧ-активности ограниченно деполимеризованного хлорида хитозония с молекулярной массой 2-15 кДа. Данный препарат подавлял репликацию ВИЧ-1 на 81%. В статье описаны возможные механизмы анти-ВИЧ-активности деполимеризованного хитозана.
Ключевые слова: деполимеризованный хитозан, вирус иммунодефицита человека, анти-ВИЧ-активность
Введение. Быстрый рост числа ВИЧ-инфицированных в мире и возникновение новых резистентных штаммов ВИЧ побуждает ученых к проведению скрининговых исследований различных классов химических соединений с целью создания новых лекарств. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) зарегистрировано 23 мономолекулярных соединения и 7 их комбинаций, обладающих анти-ВИЧ-активностью и выпускаемых в качестве фармацевтических препаратов [1]. Особенностью рыночных препаратов с анти-ВИЧ-активностью является их синтетическое происхождение, селективная органотоксичность и высокая стоимость. Но вектор поиска новых лекарств от ВИЧ-инфекции может быть на-
правлен и на соединения природного происхождения.
Интересными в этом отношении являются хитозан и его производные. Известно, что сульфатированные производные хитозана проявляют высокую ингибирующую активность в отношении ВИЧ [2, 3]. В работе М. R. Aghasadeghi с соавторами проведено исследование анти-ВИЧ-активности комплексов ламивудина с пегилированным хитозаном, и показано уменьшение полуэффективной дозы и цитотоксичности нового макрокомплекса по сравнению с исходным препаратом [4]. В других работах описывается применение наноразмерных частиц хитозана, как средства доставки активных низкомолекулярных соединений [5, 6]. В этих работах изучалась анти-ВИЧ-активность производных хитозана или
Тематический выпуск «(Российский научный форум на Урале»
799
транспортная способность высоко полимери-зованного хитозана.
Целью настоящей работы явилось выявление анти-ВИЧ-активности ограничено деполи-меризованного хитозана (ОДХ), полученного действием азотистой кислоты на препарат высокополимерного хитозана. В работе был применен метод скрининга анти-ВИЧ-активности EASY-HIT [7].
Материал и методы.
Вирусные стоки ВИЧ-^А1 получали на основе HEK 293 клеточной линии путем транс-фекции провирусной плазмидой pLAI.2 [8]. Для постановки EASY-HIT была использована LC5-RIC клеточная линия, являющаяся сублинией клеток HeLa, несущая на своей поверхности CD4 и CXCR4. Свойством LC5-RIC клеток является экспрессия красного флуоресцентного протеина DsRedl на rev и tat гены ВИЧ^ [9]. Клетки культивировались при 37°C в 5% атмосфере CO2 в ростовой среде DMEM (Gibco, Германия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biochrom AG, Германия) с добавлением 0,74 мг/мл генетици-на (PAA Laboratories, Австрия) и 0,125 мг/мл гигромицина B (PAA Laboratories, Австрия).
СН2ОН NHj
О. ^ + MONO
NH2 CHjOH
но
I
о T но---J* ♦
"1 он ^ СН20Н + н2о
Рис. 1. Реакция деполимеризации хитозана азотистой кислотой (по G. G. Allan, M. Peyrvn / Carbohydrate Research 277 (1995) 257-272).
В качестве тестируемого на анти-ВИЧ-ак-тивность соединения был использован ОДХ, имеющий молекулярную массу 2-15 кДа в форме раствора хлорида хитозония (рис. 1). ОДХ получали из препарата высокополимерного хитозана (300 кДа) путем поэтапной обработки раствором нитрита натрия при рН 5, осаждением щелочью (рН=9) и последующей промывкой деионизованной водой до рН 7,5 с помощью низкоскоростного центрифугирования и растворением при добавлении соляной кислоты [10]. Последующие разведения препарата проводили 0,05М раствором
натрий-фосфатного буфера для приготовления изогидрического раствора.
EASY-HIT проводили как описано в [7]. LC5-RIC клетки вносили в количестве 104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты (^CLEAR-Plate Black; Greiner Bio-One, Германия) и инкубировали в течение 24 часов до момента инфицирования. После инкубации в лунки к клеткам со средой добавляли 100 мкл ОДХ в двойных серийных разведениях (от 10 до 2,5 мг/мл) и 20 мкл ВИЧ- 1LAI (108 РНК копий/мл). Клеточный контроль и контроль инфицирования проводился путем замены соответствующего компонента на объем питательной среды. Планшеты инкубировали 48 часов, после чего проводилась детекция красного флуоресцентного протеина при помощи ИФА анализатора Tecan infinite M200 (Tecan, Германия) при длине волны возбуждения 544 нм и длине волны эмиссии 590 нм. Исследуемый супернатант переносили в новую планшету с клетками и инкубировали еще 72 часа. После чего процедуру детекции повторяли снова с целью определения ингибирующей способности поздних стадий репликации вируса.
Жизнеспособность клеток после 48 часов инкубации с исследуемым ОДХ оценивали при помощи МТТ-теста, заключающегося в способности дегидрогеназ живых клеток конвертировать и восстанавливать бесцветный водорастворимый 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид в фиолетово-голубой 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-формазан [11]. Измерение оптической плотности при помощи ИФА анализатора при 630 нм позволяло выявить жизнеспособные клетки.
Результаты. В исследуемых концентрациях от 2,5 до 10 мг/мл ОДХ не проявляет выраженной цитотоксичности по отношению к LC5-RIC клеточной культуре. Спустя 48 часов инкубации с момента заражения клеток не было выявлено высокой вирусингибирующей активности (рис. 2), подавление репликации ВИЧ-1 при максимальной исследуемой концентрации 10 мг/мл ОДХ составило 29,05%±0,09. Однако после 72 часов инкубации с момента заражения клеток, во всех исследуемых концентрациях ОДХ продемонстрировал ингиби-рующую ВИЧ-1 активность более 75%.
Обсуждение. В настоящей работе был использован метод деполимеризации исходного препарата хитозана с помощью азотистой кислоты [12], который позволяет контролировать степень фрагментации полимера соз-
■ 48 часов инкубации □ 72 часа инкубации
10 мг/мл 5 мг/мл 2,5 мг/мл
концентрация ОДХ
Рис. 2. Ингибирующая ВИЧ-1 активность ОДХ в виде хлорида хитозония.
данием определенного соотношения числа молей HNO2 к числу молей деацетилирован-ных аминогрупп. Важно отметить, что в процессе деполимеризации на одном из концов большинства получаемых фрагментов ОДХ образуется альдегидная группа, которая может присоединяться к атому серы в сульфги-дрильной группе, образуя полумеркаптали [13], и к атому азота в первичной аминной группе, образуя основания Шиффа (азоме-тины). Одним из вероятных механизмов ви-русингибирующей активности ОДХ может служить его взаимодействие с регуляторны-ми белками ВИЧ, имеющими доступные Ж-и NH2- группы, в результате чего происходит изменение биологической активности белков, что опосредованно приводит к снижению репликации вируса.
Другим механизмом действия может явиться способность хитозана проникать внутрь клетки, а также его возможная деполимеризация под действием присутствующих в клетках человека и других высших организмов ферментов: хитиназы, хитозаназы, лизоцима, глюкозаминазы и других хитинолитических комплексов [14, 15]. Можно предположить, что более длительная инкубация способствует получению оптимального размера и пространственной структуры фрагментов ОДХ, необходимых для проявления более высокой анти-ВИЧ-активности.
Обнаруженное подавление репликации ВИЧ от 81 до 75% при исследуемых высоких концентрациях ОДХ (от 2,5 до 10 мг/мл) не позволяет считать его кандидатным веществом для создания медицинских препаратов, но может учитываться при нашей дальнейшей работе над модификацией сульфатов хитозана, проявляющих высокую анти-ВИЧ-активность [2, 16].
Благодарности. Авторы статьи выражают благодарность Штефану Крэмбу и всем сотрудникам Института вирусологии Центр имени Гельмгольца Мюнхен (Helmholtz Zentrum München, Германия) за возможность проведения данного исследования при помощи скрининг-системы EASY-HIT, а так же благодарят руководителя компании ЗАО «СОНАТ» (г. Москва) Д. Б. Фраймана за любезно предоставленный препарат высокополимерного хитозана.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. AIDSinfo USDoHaHSH. HIV and Its Treatment -FDA-Approved Anti-HIV Medications. (http:// aidsinfo.nih.gov/education-materials/fact-sheets/21/58/fda-approved-hiv-medicines), 2012.
2. Корнилаева Г. В., Макарова Т. В., Гамзазаде А. И., Скляр А. М., Насибов С. М., Карамов Э. В. Иммунология 1995, 1, 13-16.
3. Nishimura S. I., Kai H., Shinada K., Yoshida T., Tokura S., et al. Carbohydr Res. 1998, Jan; 306 (3), 427-433
4. Mohammad R. A., Hossein H., Seyed M. S., Shiva I., Safieh A., et al. Current HIV Research 2013, 11, 309-320.
5. Adlin Jino Nesalina J., Anton Smith A. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences 2012, 7 (1), 80-84.
6. Lakshmi N. R., Shilpee S., Swaminathan S., Udayku-mar R., Uma M. K. Biochimica et Biophysica Acta 2014, 1840, 476-484.
7. Kremb S., Helfer M., Heller W., Hoffmann D., Wolff H., et al. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2010, 54, 5257-5268.
8. Peden K., Emerman M., Montagnier L. Virology, 1991, 185, 661-672.
9. Wolff H., Hadian K., Ziegler M., Weierich C., Kramer-Hammerle S. et al. Exp. Cell Res, 2006, 312, 443-456.
10. Кривцов Г. Г., Гендон Ю. З.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.