МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 631-639
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 759.873.088.5:661.185
АНТИАДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ACINETOBACTER CALCOACETICUS 1МВ В-7241, RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS 1МВ Ac-5017 И NOCARDIA VACCINII1МВ В-7405 © 2014 г. Т. П. Пирог1, А. Д. Конон, К. А. Береговая, М. А. Шулякова
Национальный университет пищевых технологий, Киев Поступила в редакцию 18.02.2014 г.
Исследовали прикрепление клеток некоторых бактерий, дрожжей и микромицетов к различным поверхностям (катетеры, зубные протезы, пластик, поливинилхлорид, кафель, сталь), обработанным поверхностно-активными веществами (ПАВ) из Acinetobacter calcoaceticus 1MB В-7241, Rhodo-coccus erythropolis 1MB Ac-5017 и Nocardia vaccinii 1MB В-7405. Адгезия микроорганизмов на всех исследуемых материалах зависела от концентрации и степени очистки ПАВ, типа поверхности и тест-культур. Обработка материалов растворами ПАВ из N. vaccinii 1МВ В-7405 (0.005—0.05 мг/мл), A. calcoaceticus 1МВ В-7241 (0.003-0.036 мг/мл), R. erythropolis 1МВ Ac-5017 (0.03-0.12 мг/мл) сопровождалась снижением адгезии бактерий (Escherichia coli 1ЕМ-1, Bacillus subtilis БТ-2 и др.) на 35-75, 6075, 25-90%, дрожжей Candida albicans Д-6 - на 80-85, 55-90, 15-60%, микромицетов (Aspergillus niger Р-3, Fusarium culmorum Т-7) - на 40-50, 35-45, 10-20% соответственно.
Ключевые слова: Acinetobacter calcoaceticus 1МВ В-7241, Rhodococcus erythropolis 1МВ Ac-5017, Nocardia vaccinii 1МВ В-7405, поверхностно-активные вещества, адгезия микроорганизмов, абиотические поверхности.
DOI: 10.7868/S0026365614060160
Формирование микробных биопленок на различных поверхностях оборудования в пищевой промышленности и медицине является опасным явлением, поскольку микроорганизмы в их составе характеризуются повышенной резистентностью к различным биоцидам [1-3]. В последние годы особое внимание уделяется исследованию микробных поверхностно--активных веществ (ПАВ) как антиадгезивных агентов, способных предотвращать образование биопленок [4-7].
Ранее из загрязненных нефтью образцов почвы нами были выделены нефтеокислящие бактерии, идентифицированные как Acinetobacter calcoaceticus К-4 (1МВ В-7241), Rhodococcus erythropolis ЭК-1 (1МВ Ас-5017), Nocardia vaccinii K-8 (1МВ В-7405) [8], установлена способность штаммов синтезировать метаболиты с поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами, разработаны подходы к интенсификации синтеза ПАВ на различных углеродных субстратах, в том числе и промышленных отходах [9-13], и показана возможность их практического использования в природоохранных технологиях и в качестве антимикробных агентов [11, 12, 14].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: tapirog@nuft.edu.ua).
Цель данной работы — исследовать влияние поверхностно-активных веществ А. сакоасвИсш 1МВ В-7241, Я. вгу^гороШ 1МВ Ас-5017 и N. уас-сти 1МВ В-7405 на прикрепление клеток бактерий, дрожей и микромицетов к различным поверхностям.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследований. Основными объектами исследований являлись штаммы Якоёососсш вгуЛгороШ ЭК-1, Аапв1оЬас1вг сакоасвИсш К-4 и ЫосаШа уасстп К-8, зарегистрированные в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного Национальной академии наук Украины под номерами 1МВ Ас-5017, 1МВ В-7241 и 1МВ В-7405 соответственно.
По химической природе внеклеточные ПАВ Я. вгуЛгороШ 1МВ Ас-5017 являются комплексом гликолипидов (трегалозомоно- и димикола-ты), нейтральных липидов (цетиловый спирт, пальмитиновая кислота, метиловый эфир н-пен-тадекановой кислоты, миколовые кислоты) и фосфолипидов (фосфатидилглицерин, фосфати-дилэтаноламин) [9]. В составе внеклеточных ПАВ А. сакоасвИсш 1МВ В-7241 выявлены глико- (тре-
галозомоно- и димиколаты, трегалозомоно- и ди-ацелаты) и аминолипиды [9]. Штамм 1MB В-7405 синтезирует комплекс внеклеточных нейтральных, глико- и аминолипидов [9]. Нейтральные липиды представлены миколовыми и н-алкано-выми кислотами, гликолипиды — трегалозоди-ацелатами и трегалозомиколатами.
В работе использовали также также штаммы бактерий (Escherichia coli 1ЕМ-1, Bacillus subtilis БТ-2, Proteus vulgaris БТ-1, Staphylococcus aureus БМС-1, Pseudomonas aeruginosa П-55, Enterobacter cloacae АС-22), дрожжей (Candida albicans Д-6) и микромицетов (Aspergillus niger Р-3, Fusarium cul-morum Т-7) из коллекции живых культур кафедры биотехнологии и микробиологии Национального университета пищевых технологий.
Состав сред и условия культивирования. R. erythropolis 1MB Ac-5017 выращивали в жидкой минеральной среде (г/л): NaNO3 — 1.3, MgSO4 • 7H2O - 0.1, NaCl - 1.0, Na2HPO4 - 0.6, KH2PO4 - 0.14, FeSO4 • 7H2O - 0.01, рН 6.8-7.0. В качестве субстрата использовали подсолнечное масло в концентрации 2% (по объему).
Для культивирования A. calcoaceticus 1MB В-7241 использовали питательную среду следующего состава (г/л): (NH2)2CO - 0.35, MgSO4 • 7H2O - 0.1, NaCl - 1.0, Na2HPO4 - 0.6, KH2PO4 - 0.14, рН 6.87.0. В среду дополнительно вносили дрожжевой автолизат - 0.5% (по объему) и раствор микроэлементов - 0.1% (по объему) [9]. Источник углерода - этанол в концентрации 2% (по объему).
Штамм N. vaccinii 1MB В-7405 выращивали в синтетической питательной среде (г/л): NaNO3 -0.5, MgSO4 • 7H2O - 0.1, CaCl2 • 2H2O - 0.1, KH2PO4 - 0.1, FeSO4 ■ 7H2O - 0.1, дрожжевой ав-толизат - 0.5% (по объему). Источник углерода и энергии - глицерин в концентрации 1.0% (по объему).
В качестве инокулята использовали культуры в экспоненциальной фазе роста, выращенные в соответствующих жидких средах, содержащих 0.5-1% (по объему) субстрата. Количество посевного материала (104-105 кл/мл) составляло 5-10% от объема питательной среды. Культивирование бактерий осуществляли в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалке (320 об/мин) при 28-30°С в течение 120 ч.
Выделение поверхностно-активных веществ. Из культуральной жидкости, содержащей ПАВ (препарат 1), экстракцией смесью хлороформа и метанола в соотношении 2 : 1 (смесь Фолча) выделяли ПАВ (препарат 2). Оставшаяся после экстракции ПАВ водная фаза условно названа нами препарат 3.
Выросшие клетки отделяли центрифугированием (5000 g) в течение 45 мин, супернатант (препарат 1) подвергали дальнейшей обработке. Для этого к 50 мл супернатанта добавляли 50 мл смеси
Фолча, и экстрагировали липиды в течение 5 мин. После разделения фаз отбирали верхнюю фракцию (препарат 2), нижнюю фракцию сливали (органический экстракт 1), а водную фазу подвергали повторной экстракции, как описано выше. После разделения фаз сливали нижнюю фракцию, получая органический экстракт 2. На третьем этапе к водной фазе добавляли 50 мл смеси Фолча, осуществляли экстракцию, получая органический экстракт 3. Экстракты 1—3 объединяли и упаривали на роторном испарителе ИР-1М2 (Россия) при 50°С и абсолютном давлении 0.4 атм до постоянной массы. Сухой остаток растворяли в стерильной водопроводной воде до первоначального объема (препарат 3). Все препараты стерилизовали при 112°С в течение 30 мин.
Концентрацию ПАВ в препаратах 1 и 2 устанавливали весовым методом после экстракции смесью Фолча.
Исследование антиадгезивных свойств ПАВ. Для
исследования антиадгезивных свойств [15—17] очищенные пластинки исследуемых материалов (зубные протезы, кафель, нержавеющая сталь, пластик, линолеум (поливинилхлорид) одинакового размера (1 см2) стерилизовали при 112°С в течение 40 мин, а фрагменты мужских урогени-тальных катетеров (силиконовый материал) погружали в 75%-ый раствор спирта на 20 мин, после чего помещали в раствор исследуемых препаратов 1—3 и высушивали в течение 24 ч в термостате при 30°С. Односуточные тест-культуры бактерий, дрожжей и трехсуточные микроми-цетов, выращенные на мясо-пептонном (МПА) и глюкозо-картофельном агаре (ГКА) соответственно, суспендировали в 100 мл стерильной водопроводной воды, в суспензию помещали предварительно обработанные препаратами 1—3 и необработанные (контрольные) материалы, выдерживали 2 ч в термостате при 30°С, после чего ополаскивали 10 мл стерильной водопроводной водой для удаления неадгезированных клеток.
Далее определяли степень адгезии клеток двумя методами.
Метод Коха [16, 17]. Исследуемые материалы помещали в колбы с 20 мл стерильной водопроводной воды и шариками бисера, встряхивали в течение 5 мин для десорбции адгезированных клеток. В полученной суспензии определяли количество живых клеток по методу Коха на МПА (для бактерий) и ГКА (для дрожей и микромицетов). Количество (%) адгезированных клеток (адгезия) определяли как отношение клеток на предварительно обработанных препаратами 1—3 образцах к количеству клеток на контрольних образцах (100%).
Спектрофотометрический метод [15, 16]. Пластинки материалов обрабатывали метанолом (99%) в течение 15 мин для фиксации адгезиро-
ванных клеток и высушивали при комнатной температуре, после чего помещали на 5 мин в 1% раствор генцианвиолета и ополаскивали водопроводной водой. После высушивания материалы обрабатывали 10 мл 33% раствора уксусной кислоты и измеряли оптическую плотность полученной суспензии десорбированных клеток. Количество (%) адгезированных клеток (адгезия) определяли как отношение оптической плотности суспензии, полученной из обработанных препаратами 1—3 образцов к оптической плотности контрольных образцов (100%).
Все опыты проводили в 3 повторностях, количество параллельных определений в экспериментах составляло от 3 до 5. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, как описано ранее [10]. Различия средних показателей считали достоверными при уровне значимости р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Адгезия микроорганизмов на медицинских материалах, обработанных микробными ПАВ. Ежедневная практика интенсивной терапии предполагает многочисленные инвазивные вмешательства (катетеры, имплантаты, протезы и др.), связанные с нарушением целостности кожных покровов и слизистых оболочек, что провоцирует проникновение широкого спектра патогенных микроорганизмов в организм человека [18]. Только в США образование биопленок на медицинских материалах явилось причиной приблизительно 100 тысяч смертей за период с 2000 г.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.