научная статья по теме АНТИАМИЛОИДНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА С60 Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИАМИЛОИДНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА С60»

БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 3, с. 416-421

МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА ==

УДК 577.3

АНТИАМИЛОИДНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА C60

© 2012 г. А.Г. Бобылёв*, М.Д. Шпагина*, Л.Г. Бобылёва*, А.Д. Окунева* ***,

Л.Б. Пиотровский**, З.А. Подлубная* ***

*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Pоссийской академии наук, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;

E-mail: bobylev7@rambler.ru **Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Pоссийской академии медицинских наук, 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12; ***Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, Проспект науки, 3 Поступила в p едакцию 20.03.12 г.

C помощью электронной микроскопии и флуориметрии проведена сравнительная оценка антиамилоидной способности комплексов фуллерена Cgo с поливинилпирролидоном, а также производных фуллерена Cgo (натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена Cgo и фуллеренолата натрия). Исследуемые фуллерены разрушали амилоидные фибриллы ЛР(1-42)-пептида мозга и мышечного X-белка. Изучение действия фуллеренов на мышечный актин показало, что комплексы фуллерена Cgo с поливинилпирролидоном и фуллеренолат натрия не препятствовали филаментообразованию актина и не разрушали его нити in vitro. Напротив, натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Cgo разрушала нити актина, а также препятствовала их формированию. Делано заключение, что среди исследованных фуллеренов фуллеренолат натрия и комплексы фуллерена Cgo с поливинилпирроли-доном являются наиболее эффективными антиамилоидными веществами.

Ключевые слова: амилоиды, мышечный X-белок, А в-пептиды, фуллерены, амилоидозы.

В настоящее время фуллерены рассматривают как потенциальные лекарственные препа -раты, в том числе и при нейродегенер ативных заболеваниях, благодаря таким уникальным свойствам, как нейропротекция и высокая ан-тиоксидантная активность [1—5]. Биологическое действие фуллеренов обуславливается прежде всего тем, что, несмотря на большое количество атомов, молекула фуллерена компактна. Диаметр молекулы Сб0 равен ~ 0,71 нм (при молекулярной массе 720 Да), что сравнимо с размерами органических молекул, таких как бензол или фенилаланин, и меньше размера более сложных молекул, таких как АМФ [б].

Однако сер ьезным осложняющим фактором при исследовании биологических свойств самого фуллерена и большинства его производных является их практически полная нерастворимость в полярных растворителях [7-9]. Для решения этой проблемы используются: стабильные коллоидные растворы фуллеренов в воде [10]; нековалентные комплексы фуллеренов с

Cокpащения: ТТ - тиофлавин Т.

гидрофильными органическими молекулами, в том числе с полимер ами; синтезированные водорастворимые производные фуллеренов.

Эти подходы имеют свои достоинства и недостатки. В коллоидных растворах фуллере-нов, как и в некоторых нековалентных комплексах, молекулы фуллерена находятся в виде ассоциатов [б]. Присоединение радикала к молекуле фуллерена приводит к изменению природы самого фуллеренового ядра, причем чем больше степень замещения, тем более выражено это изменение [11]. Поэтому физические, химические и биологические свойства фуллеренов, а также их ковалентных производных могут принципиально р азличаться. К р оме того, введение объемных заместителей может стерически блокир овать само фуллереновое ядро, что также скажется на его способности проявлять собственные биологические свойства.

Цель этой работы - сравнительное исследование антиамилоидных свойств комплексов фуллерена Сб0 с поливинилпирролидоном (Сб0/ПВП) (м.м. ПВП 10000 и 25000), а также производных фуллерена Сб0 (натриевой соли

Рис. 1. Электронные микрофотографии: (а,б) - спирально-скрученные ленточные фибриллы ЛР(1-42)-пептида мозга, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7,0 при 37°С; (в) -спирально-скрученные ленточные фибриллы мышечного Х-белка, сформированные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7,0 при 4°С. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетета. Шкала 100 нм.

поликарбоксильного производного фуллерена C60 (C60Cl(C6H4CH2COONa)5) и фуллеренолата натрия (NaFL)).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный материал: скелетные мышцы кролика; синтетический Ав(1-42)-пептид фирмы Sigma Aldrich. И спользуемые фуллерены: комплексы фуллерена C6o с поливинилпирроли-доном с молекулярными массами ПВП 10000 и 25000 и содержанием в них фуллерена 0,5-0,6%, полученные по методу [12]; натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена C60 и фуллеренолат натрия Na4[C60(OH)~30], полученные по методу [13], предо ставлены П .А. Тро -шиным из Института проблем химической физики РАН, Черноголовка, Россия.

Получение мышечного амилоидного X-белка. X-белок семейства тайтина был изолирован из скелетных мышц кролика по методу, описанному в работе [14]. Чистота пр епаратов X-белка была тестирована Д CН -гель-электр офорезом по методу [15] с некоторыми модификациями,

улучшающими фокусирование белковых полос в геле. Концентрация белка была определена с помощью спектрофотометра SPECORD UV VIS (Carl Zeiss Jena, ГДР), при использовании для X-белка коэффициента экстинкции Ем80мл = 1,09 [16].

Актин из скелетных мышц кролика выделили по методу, описанному в работе [17], из ацетонового порошка, приготовленного согласно процедуре [18].

Образование амилоидных фибрилл X-белка и Аß(1-42)-пептида мозга. Фибриллы X-белка были сформированы с помощью диализа про -тив растворов, содержащих 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7,0 в течение 24 ч при 4 и 37°C. Формир ование амилоидных фибрилл Aß(1-42)-пептидом было проведено в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7,0 в течение 24 ч при 37°C.

Метод флуоресцентного анализа. Исследование амилоидной природы фибрилл X-белка и Aß(1-42)-пептида мозга, а также исследование их разрушения проведено с использованием

Pис. 2. Cтpyктypа (а) - фyллеpена C60; (б) - комплекса фyллеpена C60 с поливинилпиppолидоном; (в) -натpиевой соли поликаpбоксильного пpоизводного фyллеpена C60; (г) - фyллеpенолата натpия.

классического флyоp есцентного кp асителя для амилоидных crpy^yp тиофлавина Т (ТТ). Из-меp ения флуо p есценции пp и исследовании амилоидной пpиpоды фибpилл пpоводили в pас-твоp е кp асителя (3 мкМ ТТ) и суспензии фиб-p илл (3 мкг/мл). Измеp ения флуо p есценции пp и исследовании p азp ушения амилоидных фибp илл X-белка и Aß(1-42)-пептида пpоводили в pас-твоp е ^ асителя (3 мкМ ТТ) и суспензии фиб-pилл (3 мкг/мл Aß(1-42)-пептида и X-белка в pаcтвоpе, cодеpжащем 30 мМ KCl и 10 мM имидазола, pH 7,0). Интенсивность флуо p есценции pа cтвоp а pегиcтp иp овали с помощью спек-тpофлyоpиметpа CARY Eclipse (Varían, CША) пpи длине волны 488 нм и пpи длине волны возбуждения 440 нм. Шиp ина щели пp и возбуждении и пp и p егис^ ации 3 нм.

Электронная микроскопия. Каплю суспензии белка с концешрацией 0,1 мг/мл наносили на по^ ытую углем коллодиевую пленку на медной сеточке и негативно о^ашивали 2% водным p аcтвоp ом yp анилацетата [19]. Обp азцы пp о смат-p ивали на электp онных микp о скопах JEM-100B (Jeol, Япония) и LIBRA 120 (Carl Zeiss, ^p мания) пp и увеличении 40000 x . Увеличение ми^ о скопа было тест^ овано по паp акp исталлам mp амио-зина с осевой œpиодичностью 14,3 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Мишенью действия фуллер енов был выбр ан 1-42 амилоидный в пептид (Ав(1-42)-пептид) мозга, уча ствующий в патогенезе болезни Альц-геймер а [20], и мышечный Х-белок, амилоидные свойства котор ого были откр ыты р анее в нашей лаборатории [21,22]. Фибриллы этого белка и пептида имеют сходную спир альную структуру (рис. 1), что дает нам возможность провести ср авнительную оценку их р азрушения.

Методом электронной микроскопии ранее мы пр одемонстр ир овали антиамилоидную способность гидр атир ованнного фуллер ена С60 по отношению к фибриллам Х-белка, Ав(25-35)-пептида и А в(1-42)-пептида [23,24]. Добавление гидр атир ованного фуллер ена к спир ально скр ученным лентам Х-белка, Ав(25-35)-пептида и А в(1-42)-пептида пр иводило к их декор ации сфер ическими частицами фуллер ена, уменьшению длины и шир ины лент. Более того, Х-белок в молекулярной форме и Ав(25-35), Ав(1-42)-пептиды в присутствии гидр атир ованного фуллер ена не фо р мир овали амилоидных фибр илл.

С помощью электронной микроскопии мы показали, что С60/ПВП (р ис. 2б), С60С1(С6Ы4СЫ2СООКа)5 (рис. 2в) и КаБЬ (рис. 2г) разрушали амилоидные фибриллы Ав(1-42)-пептида мозга и мышечного Х-белка

Рис. 3. Электронные микрофотографии: (а) - нитей актина в 0,1 М растворе КС1, рН 7.0; (б) - актина в присутствии Сбс/ПВП, добавленного до формирования нитей; (в) - актина в присутствии СбцПВП, добавленного после формирования нитей. Весовое соотношение актина и Сб^/ПВП 1:1; актин в присутствии Сб0С1(СбН4СН2СООКа)5, добавленной до (г) и после (д) образования филаментов. Весовое соотношение актина и Сб0С1(СбН4СН2СООЙа)5 1:1. Инкубация 24 ч. Негативное окрашивание 2% водным раствором уранилацетата. Шкала 100 нм.

и предотвращали их образование [25-27]. Ан- Сб0С1(СбН4СН2СООКа)5 был подтвержден флуо-тиамилоидный эффект КаБЬ и ресцентным анализом [28].

Разрушение амилоидных фибрилл А в(1-42)-пептида и X-белка данными пр оизводными фул-лерена приводило к значительному снижению интенсивности флуоресценции ТТ. А в(1-42)-пептид и X-белок в присутствии NaFL и C60Cl(C6H4CH2COONa)5, добавленных до формирования ими амилоидных фибр илл, после 24 ч инкубации не увеличивали интенсивность флуоресценции тиофлавина Т. Это также свидетельствует о способности NaFL и C60Cl(C6H4CH2COONa)5 предотвращать обра -зование амилоидных фибрилл.

Таким образом, мы показали, что фуллерен C60 и его водорастворимые производные разрушали амилоидные фибриллы мышечного X-белка. В данной работе было проверено действие исследуемых фуллеренов на другие фибриллярные системы мышц. Так как фибриллы актина являются одним из основных структурных

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком