БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 6, с. 1125-1133
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3
АНТИДИАБЕТИЧЕСКИЙ П P ЕПАРАТ «МЕТФО P МИН» -ДОНОР ОКСИДА АЗОТА: ЭПР-СПЕКТРОСКОПИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ «МЕТФОРМИНА»
© 2011 г. В.А. Сереженков, И .С. Кузнецов*, Т.И. Романцова*, М.И. Кузнецова**, А.Ф. Ванин
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4; *Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119992, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2; **Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина,
109472, Москва, ул. А кадемика Скрябина, 23 Email: $еге1кепкоу@ро1утег. скрк. ras. ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
Показано, что метформин, препарат, используемый при терапии диабета второго типа, метабилизируется в печени и тонком кишечнике мышей in vivo с высвобождением оксида азота. Далее высвобождающийся оксид азота образует парамагнитные моно- и динитрозильные комплексы железа, которые могут быть зарегистрированы методом ЭП P. П редполагается, что именно оксид азота ответственен за разнообразное терапевтическое действие метформина -снижение уровня сахара в крови, артериального давления и другие биологические эффекты.
Ключевые слова: оксида азота, метформин, динитрозильные комплексы железа, диабет второго типа, метод ЭПР.
В общую картину сердечно-сосудистых заболеваний населения планеты существенный вклад вносят пациенты с метаболическим синдромом и с его крайней формой проявления -сахарным диабетом втор ого типа на развитых стадиях заболевания (СД 2). Для коррекции ин-сулиновой резистентности, как одной из причин комплекса метаболических нарушений у пациентов с С Д 2, эффективно используется пр епарат бигуанидинового ряда - метформин (Мф), его структурная формула (I) представлена на рис. 1.
П ри применении Мф в суточных дозах от 500 до 3000 мг достигается снижение концентрации глюкозы в крови благодаря уменьшению инсулинорезистентности и уровня глико-зилированного гемоглобина. Комплексный подход к терапии метаболического синдрома с помощью метформина и других препаратов позволяет достигать снижения веса у пациентов и нормализации артериального давления. Пре-
Сокращения: СД2 - сахарный диабет 2 типа; Мф - метформин; N0 - оксид азота; МНКЖ ДЭТК - мононит-розильные комплексы железа с диэтилдитикарбаматом; МГД - ^метил-Б-глюкозаминдитиокарбамат; МО - молекулярная орбиталь, ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа; СТС - сверхтонкая структура; АМП-киназа -аденозин монофосфат активированная протеинкиназа.
парат снижает давление при диабете у человека [1,2] и в случае применения диабетической модели на животных [3,4]. На больных с артериальной гипертензией без диабета Мф оказывает мягкое гипотензивное действие [1].
Вместе с тем у пациентов, принимающих Мф, обнаруживается ряд эффектов, которые позволяют пр едполагать, что в ходе метаболических превращений Мф продуцирует некоторый агент (или агенты), обеспечивающие не только снижение резистентности к инсулину, но и другие разнообразные позитивные явления. Так, в ряде широкомасштабных наблюдений показано, что применение препарата меняет липидный профиль у диабетических пациентов: в плазме снижается уровень свободных жирных кислот и степень их окисления [5], отмечается уменьшение уровня триглицеридов, общего хо -лестерина и повышается уровень липопротеи-дов высокой плотности [2]. При терапии Мф у пациентов с СД2 обнаруживается активация фибр инолиза и снижение агрегации тромбоцитов [6].
Наряду с исследованиями, свидетельствующими о высокоэффективном клиническом действии Мф при лечении СД 2, заслуживают внимания сообщения о лечении такого заболева-
P ис. 1. Структур ные фор мулы метфор мина и L-ар-гинина.
ния, как поликистоз яичников у женщин. Было продемонстрировано положительное действие Мф, позволившее многим пациенткам не только кар динально улучшить свое здор овье, но и давшее возможность родить детей [7]. Разноплановость действия Мф проявляется не только на уровне макроорганизма в целом, но и в опытах in vitro. В культуре остеобластов метфор мин дозозависимо увеличивает клеточную пр олифер ацию, пр одукцию коллагена пер вого типа, активность щелочной фосфатазы и минерализацию [8]. По мнению Molinuelo и соавт.
[9] в клетках костного мозга метфор мин способствовал существенной экспр ессии о стеобла-стического и адипогенного тр анскр ипционных факторов Runx 2b и PPARу соответственно.
Таким обр азом, для Мф обнар уживает ся физиологическая активность, характерная для оксида азота (NO), - одного из универсальных регуляторов метаболических процессов в организме животных и человека. В качестве эндо-генного источника NO выступает L-ар гинин -субстрат NO-синтаз (NOS), катализирующих окисление кислор одом гуанидинового фр агмен-та в этой аминокислоте с высвобождением свободных молекул NO, его ст р уктур ная фо р мула пр едставлена на р ис. 1 (II).
В качестве доноров NO могут выступать р азличные соединения, содер жащие как гуани-диновую, так и оксигуанидиновую гр уппир овки
[10]. Р анее было показано, что гуанидины пр и метаболизировании под действием цитохрома Р450 высвобождают оксид азота в печеночном гомогенате и в гепатоцитах [11]. Поскольку Мф - соединение бигуанидинового ряда, есть о снование пр едполагать, что окисление гуани-диновой гр уппир овки в Мф также должно п р и-водить к образованию в организме человека и животных NO [10-13]. Это пр едположение под-твер ждается гипотензивным действием Мф как у пациентов с синдромом СД2, для которых, как пр авило, хар актер на гипер тония [1,2,14,15], так и у людей с повышенным давлением, но не страдающих диабетом [1,16]. Аналогичное действие Мф обнаруживалось на диабетической модели у животных [3,4]. Гипотензивная актив-
ность N0 и его донор ов, обусловленная их ва-зодилататорным действием, - одно из проявлений физиологической активности этих агентов.
Так, защитный эффект Мф пр и 30-дневной тер апии обнаруживается в опытах на изолир о -ванных легочных артериях от крыс с гипертен-зией. Показано, что вазо спастическое действие агониста а-адр ено р ецепто р а фенилэфр ина (ме-затона) на них снижено. Точно такой эффект отмены вазоконстрикторного действия фенилэфр ина обнаруживается и на артериальных кольцах, полученных от нор мальных кр ы с, пр и инкубир овании их в 4 мМ р а створ е метфор мина в течение 2,5 ч. В этих опытах Мф ингибир ует вазоконстр икцию со судов легких и улучшает функции эндотелия при легочной гипертензии [17]. В работе [18] наблюдали, что однокр атная обработка Мф защищает коронарную артерию сер дца кр ы сы от спазмир ования спустя 24 ч и снижает примерно на 50% зону инфаркта по отношению к контр ольной группе. Наконец, в опытах с добавлением Мф в культуру гепато-цитов человека было обнаружено появление в этих клетках значительного количества нитр о -тирозина [19]. Такая модификация тирозина наблюдается пр и действии на него пер оксинит-рита - соединения, образующегося в реакции N0 с супер оксидом.
Все эти факты полностью согласуются с предположением о способности Мф функцио-нир овать в о р ганизме человека и животных не только в качестве пр епар ата для снижения резистентности к инсулину, но и как непосредственного донор а N0, спо собного оказывать р азнообр азное физиологическое действие. Косвенным подтверждением данного пр едположе-ния являются результаты работы [20], в котор ой обнаружено повышение уровня нитрита, как продукта окисления N0, у пациентов, принимавших Мф. Однако прямого опр еделения N0, обр азующегося в о р ганизме животных и человека , до сих пор не пр оводилось. Такая оценка проведена в настоящей работе в экспериментах на мышах с использованием в качестве селективной спиновой ловушки N0 гидрофобных комплексов железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК), шир око используемых многими исследователями для качественного и количественного опр еделения N0 в о р ганизме животных при введении им разнообразных доноров этого агента [21,22].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В опытах с метфор мином использовали химический препарат Мф фирмы Sigma (США) или медицинский пр епар ат Мф фир мы Фор мин
Плива (Xорватия), разрешенный для лечения пациентов, с 70-80% содер жанием бигуанидина. Медицинский препарат Мф перед употреблением подвер гали дополнительной очистке фильтр ованием чер ез бумажный фильтр. В опытах использовали р а створ ы Мф с концентр а -цией 10-30 мМ. Типичный оптический спектр очищенного Мф, за р еги стр ир ованный на спектр офотометре Shimadsu 250 1РС, представлен на р ис. 2.
В молекулах, имеющих гетер оатомы азота, высшими занятыми молекулярными орбитами в о сновном со стоянии являются n-ор битали. При поглощении энергии перенос электрона о существляется с молекуляр ной о р битали (МО) (п) на МО (п*) со значением большей энер гии, фактически имеющей хар актер атомной ор битали. Поэтому предполагается, что максимум в спектре поглощения бигуанидина с Á = 232 нм определяется наличием пяти атомов азота двух гуанидиновых группир овок.
В экспериментах использовали диэтилди-тиокарбамат (ДЭТК) фирмы Serva (США), пре-пар ат сер нокислого закисного железа фир мы Fluka (Швейцар ия), L-цистеин и L-NAME фирмы Sigma (С ША), N-метил-Б-глюкаминдитио -кар бамат (МГД), синтезир ованный по методу, описанному в [23]. Газообразный оксид азота получали в реакции сульфата железа в 0,1 М Н Cl с по следующей очисткой методом низко-темпер атур ной сублимации в вакуумной системе. Синтез парамагнитных мононитрозильных комплексов железа с ДЭТК, и спользовавшихся в качестве эталонных обр азцов пр и оценке методом ЭПР концентр ации пар амагнитных центр ов, которые возникали в тканях опытных животных, пр оводили путем обр аботки газоо-обр азным NO ра створ ов двухвалентного железа и ДЭТК с известной концентр ацией в ра створ е диметилсульфок сида.
Эксперименты проводили на беспородных мышах весом 20-23 г. В основной серии опытов по пр овер ке спо собности Мф пр одуцир овать в организме животных оксид азота метморфин вводили в дозе 2 мг на животное. Для улавливания NO в организме мышей использовали гидр офобные комп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.