РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 38-47
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ТИРЕОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
© 2008 г. В.Б. Климович, А.А. Пиневич, И.Я. Руденко,
О.А. Шашкова
ФГУ Российский научный центр радиологии и хирургических технологий (РНЦРХТ) Росмедтехнологий, Санкт-Петербург, Россия
Поступила: 03.12.07 г. Принята: 18.12.07 г.
Методами иммуноферментного и иммуногистохимического анализа изучена перекрестная реактивность 52 моноклональных антител против тиреоглобулина человека, их эпи-топная специфичность и зависимость распознаваемых ими эпитопов от конформации. Большинство антител взаимодействовали с тиреоглобулинами животных одного или нескольких видов. Девять реагентов распознавали эпитопы, специфичные для тиреоглобулина человека. Двадцать моноклональных антител ингибировали связывание с антигеном только одноименных меченых реагентов, из чего следовало, что они распознают отдельные пространственно изолированные эпитопы. Тридцать два антитела были объединены в 14 групп взаимного ингибирования связывания. Для анализа состава групп взаимного ингибирования впервые применен подход, основанный на сопоставлении данных об эпи-топной специфичности моноклональных антител и их перекрестной реактивности. В пределах первых семи групп моноклональные антитела обладали одинаковыми спектрами видовой специфичности, из чего следовало, что каждая группа содержит антитела с идентичной эпитопной специфичностью. Антитела семи оставшихся групп, взаимно ингиби-руя связывание с антигеном, различались по видовой специфичности. Это позволило заключить, что антитела в указанных группах направлены против разных, но топографически сближенных эпитопов. Суммарно изученная совокупность моноклональных антител распознает на молекуле тиреоглобулина человека 41 эпитоп, из которых 15 охарактеризованы как линейные, а 26 как конформационные. Использованный подход к анализу групп взаимного ингибирования может быть применен при изучении эпитопов различных эволюционно консервативных антигенов. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 05-04-48862-а).
Ключевые слова: тиреоглобулин, антигенные детерминанты, эпитопный анализ, моноклональные антитела
ВВЕДЕНИЕ
Тиреоглобулин (ТГ), йодированный глико-протеин, синтезируемый клетками эпителия щитовидной железы [1, 2], является предшественником тиреоидных гормонов. Молекулы ТГ человека и ряда млекопитающих представляют собой гомодимеры с молекулярной массой 660 кДа, построенные из полипептидных цепей длиной около 2770 аминокислотных остатков [3]. Синтезированные молекулы ТГ претерпевают множественные пост-
Адрес: 197758 Санкт-Петербург, Ленинградская ул., 70/4, Песочный-2. Е-таП: vklim@sertolovo.ru
трансляционные модификации (присоединение атомов йода, фосфатных, сульфатных и углеводных групп) и транслокации (экспорт из тиреоцитов, включение в состав коллоида, импорт в тиреоциты и трансцитоз), взаимодействуя при этом с рядом рецепторов, транспортных белков и ферментов. В настоящее время идентифицированы лишь некоторые сайты молекул ТГ, участвующие в этих взаимодействиях [4, 5].
Одним из подходов к выявлению функциональных сайтов белков, в том числе и ТГ, является изучение его антигенных детерминант (эпитопов) с помощью моноклональных антител (МКАТ). Преимущество МКАТ состоит в том, что они распознают отдельные участки
поверхности (эпитопы) антигенов. Эти участки могут находиться вблизи функциональных сайтов молекулы или топографически совпадать с ними, что позволяет исследовать связи между структурой и функциями молекул [6]. МКАТ дают также возможность определить, относится ли распознаваемый ими эпитоп к категории линейных или зависимых от кон-формации молекулы [7, 8].
Панели МКАТ против ТГ человека и животных получены в нескольких лабораториях [7, 8, 9, 10]. Число включенных в них реагентов обычно не превышает двадцати. Гибридо-мы-продуценты этих МКАТ происходят от иммунных лимфоцитов мышей линии BALB/c (Н^).
В лаборатории гибридомной технологии ФГУ «РНЦРХТ Росмедтехнологий» (ранее ЦНИРРИ) создана уникальная панель МКАТ против ТГ человека, частично описанная в предшествующих публикациях [11, 12, 13]. Панель состоит из МКАТ, синтезируемых ги-бридомами, полученными на основе иммунных лимфоцитов мышей линии SJL/J. Животные указанной линии отличаются от BALB/c главным локусом гистосовместимости (Н^), аллотипом иммуноглобулинов и репертуаром иммунного ответа [14, 15].
Цель настоящей работы состояла в изучении перекрестной реактивности МКАТ с ТГ животных разных видов, их эпитопной специфичности и зависимости распознаваемых ими антигенных детерминант от конфор-мации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антитела. В работе использованы 52 МКАТ против ТГ человека, часть которых описана ранее. Для получения асцитных жидкостей штаммы гибридомных клеток прививали мышам F1(SJL/JxBALB/c), поддерживаемым в виварии лаборатории. В экспериментах использовали МКАТ в нативной форме и в виде приготовленных в лаборатории конъюгатов с пероксидазой [16] или изотиоцианатом флуо-ресцеина [17] (Sigma, США и Serva, Германия, соответственно).
Антигены. Были использованы коммерческие препараты ТГ быка и свиньи (Sigma, США). Препараты ТГ человека, крысы, мыши и курицы были получены в лаборатории из гомогенатов щитовидных желез солевой экстракцией с последующей очисткой методом гель-фильтации [18]. Денатурированный ТГ
человека получали восстановлением дисуль-фидных связей 0,01% 1,4-дитиотреитолом (ДТТ) (Serva, Германия) с последующим алки-лированием йодацетамидом (Serva, Германия).
Перекрестную реактивность МКАТ с очищенными препаратами ТГ человека и животных исследовали методом непрямого иммуно-ферментного анализа (ИФА). В лунки планшетов с иммобилизованным ТГ вносили растворы, содержащие МКАТ. Для выявления МКАТ, связавшихся с ТГ, использовали полученные в лаборатории аффинно очищенные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с перокси-дазой.
Взаимодействие МКАТ с ТГ на срезах ткани щитовидной железы выявляли методом иммунофлуоресценции или иммуногистохи-мически при помощи меченых щелочной фосфатазой козьих антител против иммуноглобулинов мышей (Sigma, США). Для проведения ферментной реакции использовали субстрат-хромогенную смесь Fast red TP/Naphthol AS-MX-phosphate (Sigma, США). Образцы ткани щитовидной железы человека (n = 10), собаки (n = 8), кошки (n = 9), кролика (n = 2), крысы (n = 10), мыши (n = 14), курицы (n = 3), голубя (n = 1) и лягушки (n = 4) фиксировали в 10%-ном водном формалине (Вектон, Россия), заливали в парапласт (Sigma, США) и готовили срезы толщиной 3 — 5 мкм. Сохранность гистологической структуры щитовидной железы контролировали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммунореактивность ТГ восстанавливали при помощи демаскирующей обработки путем нагревания в течение 5 мин в 0,01М цитратном буфере (рН 6,0) при 90—100°С. Для блокирования неспецифического связывания срезы инкубировали в фосфатно-солевом буфере с 10% сывороткой крупного рогатого скота (БиолоТ, Россия).
Эпитопную специфичность МКАТ исследовали методом конкурентного ИФА. Оценивали способность немеченых МКАТ ингибировать связывание меченых пероксидазой конъюгатов с адсорбированным на твердой фазе ТГ человека [19]. Оптическую плотность при взаимодействии меченых МКАТ с ТГ в отсутствие немеченых антител принимали за 100%. Достоверным считали ингибирование связывания, при котором оптическая плотность проб снижалась не менее чем на 70%.
Рис. 1. Иммуногистохимическое выявление ТГ при помощи МКАТ 12G9 на срезах ткани щитовидной железы человека (а), мыши (б), кошки (в), кролика (г), голубя (д) и лягушки (е). Ядра окрашены гематоксилином. Увеличение 200х (б, в, г), 400х (а, д) и 800х (е).
Зависимость от конформации эпитопов, связывающих МКАТ, определяли путем сопоставления реакции МКАТ с нативным и денатурированным ТГ человека в непрямом твердофазном ИФА [19]. Показатели оптической плотности при взаимодействии каждого из МКАТ с нативным ТГ (контроль) принимали за 100%. Оптическую плотность при связывании МКАТ с денатурированным антигеном выражали в процентах от контроля.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Перекрестные реакции МКАТ с ТГ животных
Изучение реакций МКАТ с очищенными ТГ человека и животных методом ИФА, а также путём выявления ТГ на срезах щитовид-
ной железы методами иммунофлуоресцен-ции и иммуногистохимии дало совпадающие результаты. Суммарные данные о взаимодействии каждого из МКАТ с ТГ животных разных видов представлены в разделах I таблиц 1, 2 и 3. Из полученных результатов следует, что большинство МКАТ наряду с ТГ человека взаимодействует также с ТГ животных одного или нескольких видов. Наиболее выражена перекрестная реактивность МКАТ с ТГ млекопитающих, меньшее число МКАТ реагирует с ТГ птиц и только четыре взаимодействуют с ТГ лягушки. Эпитоп, распознаваемый МКАТ 2F2 и 12С9, был обнаружен на ТГ животных всех изученных видов. На рис. 1 представлены примеры иммуногистохимиче-ского выявления ТГ с помощью МКАТ 12С9 на срезах ткани щитовидной железы млекопитающих, птицы и амфибии.
Таблица 1. Перекрестная реактивность МКАТ, не входящих в группы взаимного ингибирования, их эпитопная специфичность и характеристика распознаваемых ими эпитопов
Коды нативных МКАТ
N 3 « ^
^ О 2 И й м £ >о ю Щ
03
\о
м
т-Н VI Г)
О О 09
тН VI УО
а
ш
N
ь ь
г- оо
СП 2
^ и
0\ СТ\
О Я
00
09
00
Тиреоглобулины
Человека
Быка
Свиньи
Собаки
Копки
Кролика
Крысы
Мыши
Курицы
Голубя
Коды меченых МКАТ
I. Взаимодействие с ТГ *
II. Ингибирование связывания меченых МКАТ с ТГ человека **
1Б10
2А2
5Б11
5И6
6Е7
8Е11
4В1
5Е6
Ю1
5в5
6В2
2А4
2Б5
7Б12
8Б10
4СЗ
2С12
2С9
8В9
8В1
Эпитоп ТГ
Ш. Характеристика эпитопов ***
Конформаци-
онный
Линейный
Примечание: (*) присутствие на антигене эпитопа, распознаваемого МКАТ, обозначено заливкой; (**) ингибирование обозначено заливкой; (***) символом (•) отмечена принадлежность эпитопа к категории конформационных или линейных.
2. Эп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.