УДК 579.61
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА Trichoderma ИЗ СРЕДНЕЙ СИБИРИ
© 2015 г. В. С. Садыкова*, А. В. Кураков**, А. Е. Куварина**, Е. А. Рогожин*
* Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, Москва, 119021 ** Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119991
e-mail: sadykova_09@mail.ru Поступила в редакцию 01.10.2014 г.
Изучена антибиотическая активность у 42 штаммов 8 видов рода Trichoderma — T. asperellum, T. viride, T. hamatum,T. koningii, T. atroviride, T. harzianum, T. citrinoviride и T. longibrachiatum, выделенных из различных экотопов Сибири. Показаны различия между представителями этих видов по степени проявления ими антибактериальной и антигрибной активности. Отобран штамм T. citrinoviride TV4-1 с высокой активностью и широким спектром действия по отношению к условно-патогенным и патогенным грибам рода Aspergillus и Candida albicans, бактериям, включая метицилинрезистентный золотистый стафилококк, и опухолевым клеткам. Согласно данным масс- и ИК-спектрометрии и спектру биологического действия наиболее вероятными активными соединениями в экстрактах культуральной жидкости штамма являются пептаиболы.
Ключевые слова: антимикотическая активность, антибактериальная активность, пептаиболы, антибиотики, микромицеты, грибы рода Trichoderma.
DOI: 10.7868/S0555109915030149
Актуальной проблемой для здравоохранения остаются онкологические и ряд инфекционных заболеваний, которые являются одними из основных причин смертности. Наблюдаемый рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, характеризуется тяжестью течения, а госпитальные инфекции связанны с резистентными формами бактерий.
Для решения этих задач необходим поиск новых эффективных соединений с требуемым спектром действия. Перспективными продуцентами таких веществ являются микроскопические грибы рода Trichoderma, синтезирующие разнообразные вторичные метаболиты с высокой биологической активностью [1—3]. К настоящему времени установлено, что представители этого рода образуют около 200 соединений с антибактериальным, антигрибным, антипротозойным и ци-тотоксическим действием [4—6]. Преимущество этих продуцентов — наличие опыта использования при производстве ферментов, препаратов для биоконтроля в растениеводстве и экологических биотехнологиях, и, соответственно, знание условий роста и промышленного культивирования для штаммов многих видов [7—10].
При поиске продуцентов новых антибиотиков одним из эффективных подходов является скрининг изолятов из удаленных и слабо изученных регионов (Сибирь, тропические страны, поляр-
ные области, засоленные водоемы, культурные слои археологических раскопов, ткани растений). Полагают, что грибы из необычных экотопов могут продуцировать антибиотики с новыми свойствами и механизмами действия на метаболизм патогенных организмов-мишеней. В последние годы выделено и описано много видов триходерм, на основе современных молекулярно-генетиче-ских методов уточнена идентификация имеющихся в коллекциях штаммов. В результате только за 20 лет список видов рода Trichoderma расширился с 35, известных до 1992 г. [11, 12], до 110 видов в 2010 г. (http://www.isth.info/biodiversity/ тёех^р).
Цель работы — скрининг продуцентов соединений с фунгицидным и антибактериальным действием среди новых штаммов рода Trichoderma, выделенных при исследовании биоценозов Средней Сибири и прилегающих к ней регионов, идентификация наиболее активных.
МЕТОДИКА
Для исследования были взяты 42 моноспоровых штамма 8 видов рода Trichoderma — Т. азреге1-1ит, T. viride, T. hamatum,T. koningii, T. atroviride, T. harzianum, T. citrinoviride, T. longibrachiatum из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Изоляты этих видов выделены из це-
линных почв, с поверхности растений, древесных остатков, плодовых тел макромицетов, собранных на территории Красноярского края, Эвенкии, республик Тыва и Хакасия [13].
Эти штаммы относятся ко второму культураль-но-морфологическому типу триходерм разных видов. По сравнению с другими известными типами (1, 3 и 4) они обладали стабильными культу-рально-морфологическими признаками при пассажах, как правило, характеризовались более высокой антибиотической активностью, скоростью роста и продуктивностью образования спор или биомассы [13].
Антимикробную активность экстрактов мицелия и культуральных жидкостей этих 42 моноспоровых штаммов изучали методом диффузии в агар с применением дисков (9 мм) [14]. Грибы выращивали стационарно в колбах на 100 мл на жидкой среде Чапека в течение 14 сут, культуральную жидкость фильтровали через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Для извлечения антибиотических веществ культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом в соотношении 3 : 1. Полученные экстракты упаривали в вакууме на
t
роторном испарителе "Rotavapor-RB ü chi" (Швейцария) при 42°C досуха, остаток растворяли в водном 60%-ном этаноле и получали спиртовые концентраты. Во всех фракциях — исходной культуральной жидкости, спиртовых концентратах, осадке и мицелии определяли антимикробную активность методом дисков.
Тест-объектами для оценки фунгицидной активности были штаммы патогенных мицелиаль-ных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans АТСС 2091, C. tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов — A. oryzae 1К, A. niger 2К, A.fumigatus 4К, A. tereus 4К, A. fisheri 3К, A.flavus7К (из коллекции НИИНА им. Г.Ф. Гаузе).
Спектр антибактериального действия изучали с использованием в качестве тест-культур штаммов грамположительных бактерий — Bacillus subti-lis АТСС 6633, B. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий — Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461 из коллекции НИИНА им. Г.Ф. Гаузе.
Тест-культуры B. subtilis АТСС 6633 и B. mycoides 537 выращивали на среде, приготовленной на бульоне Хоттингера в разведении 1 : 2 следующего состава (г/л): глюкоза — 10.0; NaCl — 2.0; агар — 20.0. E. coli ATCC 25922, M. luteus NCTC 8340, S. aureus FDA 209P, C. terrigena ATCC 8461 выращивали на МПА ("ЗАО НИЦФ", Россия), грибные тест-культуры — на среде Чапека. Использовали суточные культуры бактерий и пятисуточ-ные культуры грибов.
Бактерии выращивали в пробирках со скошенным питательным агаром, затем клетки суспендировали в физиологическом растворе до мутности 0.5 по стандарту McFarland (1.5 х 108 КОЕ/мл) и использовали в течение 15 мин. Бациллы, стафилококки и микрококки культивировали при 37°С, E. саЫ — при 42° С, B. сoagulans — при 55°С, патогенные микроскопические грибы и дрожжи выращивали при 37°С, условно-патогенные — 28°С. Инокуляцию культур на чашку осуществляли штрихами в 3-х направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси.
Фунгицидное и антибактериальное действие экстрактов штаммов оценивали с помощью стерильных бумажных дисков, смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях. Контролем служили стандартные диски с амфотерицином В ("НИИ Пастера", 40 мкг/мл) и ампициллином ("НИИ Пастера", 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур изучаемыми моноспоровыми штаммами гриба рода Trichаderma оценивали на 2 сут (для бактерий), и на 5—7 сут (для грибов). Полученные результаты интерпретировали следующим образом: 0 — активности нет; до 12 мм — слабая чувствительность; от 13 до 29 мм — средняя чувствительность; 30 мм и более — высокая чувствительность [14].
У наиболее активного продуцента антибиотиков из 42 протестированных штаммов изучали влияние состава среды и условий культивирования на биосинтез антибиотиков. Опыты проводили на жидких средах — Чапека, Сабуро и среде с 3 %-ным неохмеленным суслом. Культуры выращивали глубинным способом (на качалке 10 и 14 сут при 200 об./мин), комбинированным (5 и 7 сут на качалке, затем стационарно 5 и 7 сут) и поверхностным способом в течение 10 и 14 сут. Для экстрагирования активных фракций из культуральной жидкости использовали п-бута-нол и этилацетат, из мицелия — этанол.
Для фракционирования этилацетатного экстракта культуральной жидкости использовали комбинацию методов жидкостной хроматографии — прямофазной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной (ОФ-ВЭЖХ). В качестве сорбента для прямофазной хроматографии использовали силикагель, в качестве элюента — хлороформ с последующим увеличением процентного содержания метанола в хлороформе. Полученный этилацетатный экстракт (Кд) перерастворяли в этаноле и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле Юе8е1§е1 60 (40—63 мкм); элюцию осуществляли органическими растворителями в следующей последовательности: хлороформ, хлороформ—метанол (50 : 1 ^ ^ 10 : 1), метанол. В полученных элюатах определяли антимикробную активность методом дисков на тест культуры грибов и бактерий. Активные элю-
аты упаривали в вакууме досуха и растворяли в 3 мл 60%-ного этанола. Биоавтографию антибиотических веществ осуществляли с тест-организмами B. subtilis АТСС 6633 и А. niger INA 00760.
Цитотоксическую активность фракций отобранного штамма оценивали на 2 линиях опухолевых клеток: Colo 357 — клетки панкреатической карциномы и Т3М4 — клетки рака печени. Для этого линии клеток культивировали в монослой-ных культурах во флаконах или планшетах на среде Дульбеко (DMEM , НПП "ПанЭко", Россия) в термостате при температуре 37 °С с подачей СО2. В среды добавляли фетальную бычью сыворотку — 8%, L-глютамин — 300 мкг/мл, ампици-лин/стрептомицин — 50 мкг/мл, 2-меркаптоэта-нол - 5х10Е-5М [15].
Для анализа цитотоксичности экстрактов куль-туральной жидкости и их активной фракции использовали тест с метил-триазолтетразолием (МТТ) ("Sigma", США). МТТ-тест используется для анализа цитотоксичности потенциальных противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-ди-метилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтерар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.