научная статья по теме АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA ИЗ СРЕДНЕЙ СИБИРИ Химия

Текст научной статьи на тему «АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA ИЗ СРЕДНЕЙ СИБИРИ»

УДК 579.61

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА Trichoderma ИЗ СРЕДНЕЙ СИБИРИ

© 2015 г. В. С. Садыкова*, А. В. Кураков**, А. Е. Куварина**, Е. А. Рогожин*

* Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, Москва, 119021 ** Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119991

e-mail: sadykova_09@mail.ru Поступила в редакцию 01.10.2014 г.

Изучена антибиотическая активность у 42 штаммов 8 видов рода Trichoderma — T. asperellum, T. viride, T. hamatum,T. koningii, T. atroviride, T. harzianum, T. citrinoviride и T. longibrachiatum, выделенных из различных экотопов Сибири. Показаны различия между представителями этих видов по степени проявления ими антибактериальной и антигрибной активности. Отобран штамм T. citrinoviride TV4-1 с высокой активностью и широким спектром действия по отношению к условно-патогенным и патогенным грибам рода Aspergillus и Candida albicans, бактериям, включая метицилинрезистентный золотистый стафилококк, и опухолевым клеткам. Согласно данным масс- и ИК-спектрометрии и спектру биологического действия наиболее вероятными активными соединениями в экстрактах культуральной жидкости штамма являются пептаиболы.

Ключевые слова: антимикотическая активность, антибактериальная активность, пептаиболы, антибиотики, микромицеты, грибы рода Trichoderma.

DOI: 10.7868/S0555109915030149

Актуальной проблемой для здравоохранения остаются онкологические и ряд инфекционных заболеваний, которые являются одними из основных причин смертности. Наблюдаемый рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, характеризуется тяжестью течения, а госпитальные инфекции связанны с резистентными формами бактерий.

Для решения этих задач необходим поиск новых эффективных соединений с требуемым спектром действия. Перспективными продуцентами таких веществ являются микроскопические грибы рода Trichoderma, синтезирующие разнообразные вторичные метаболиты с высокой биологической активностью [1—3]. К настоящему времени установлено, что представители этого рода образуют около 200 соединений с антибактериальным, антигрибным, антипротозойным и ци-тотоксическим действием [4—6]. Преимущество этих продуцентов — наличие опыта использования при производстве ферментов, препаратов для биоконтроля в растениеводстве и экологических биотехнологиях, и, соответственно, знание условий роста и промышленного культивирования для штаммов многих видов [7—10].

При поиске продуцентов новых антибиотиков одним из эффективных подходов является скрининг изолятов из удаленных и слабо изученных регионов (Сибирь, тропические страны, поляр-

ные области, засоленные водоемы, культурные слои археологических раскопов, ткани растений). Полагают, что грибы из необычных экотопов могут продуцировать антибиотики с новыми свойствами и механизмами действия на метаболизм патогенных организмов-мишеней. В последние годы выделено и описано много видов триходерм, на основе современных молекулярно-генетиче-ских методов уточнена идентификация имеющихся в коллекциях штаммов. В результате только за 20 лет список видов рода Trichoderma расширился с 35, известных до 1992 г. [11, 12], до 110 видов в 2010 г. (http://www.isth.info/biodiversity/ тёех^р).

Цель работы — скрининг продуцентов соединений с фунгицидным и антибактериальным действием среди новых штаммов рода Trichoderma, выделенных при исследовании биоценозов Средней Сибири и прилегающих к ней регионов, идентификация наиболее активных.

МЕТОДИКА

Для исследования были взяты 42 моноспоровых штамма 8 видов рода Trichoderma — Т. азреге1-1ит, T. viride, T. hamatum,T. koningii, T. atroviride, T. harzianum, T. citrinoviride, T. longibrachiatum из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Изоляты этих видов выделены из це-

линных почв, с поверхности растений, древесных остатков, плодовых тел макромицетов, собранных на территории Красноярского края, Эвенкии, республик Тыва и Хакасия [13].

Эти штаммы относятся ко второму культураль-но-морфологическому типу триходерм разных видов. По сравнению с другими известными типами (1, 3 и 4) они обладали стабильными культу-рально-морфологическими признаками при пассажах, как правило, характеризовались более высокой антибиотической активностью, скоростью роста и продуктивностью образования спор или биомассы [13].

Антимикробную активность экстрактов мицелия и культуральных жидкостей этих 42 моноспоровых штаммов изучали методом диффузии в агар с применением дисков (9 мм) [14]. Грибы выращивали стационарно в колбах на 100 мл на жидкой среде Чапека в течение 14 сут, культуральную жидкость фильтровали через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Для извлечения антибиотических веществ культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом в соотношении 3 : 1. Полученные экстракты упаривали в вакууме на

t

роторном испарителе "Rotavapor-RB ü chi" (Швейцария) при 42°C досуха, остаток растворяли в водном 60%-ном этаноле и получали спиртовые концентраты. Во всех фракциях — исходной культуральной жидкости, спиртовых концентратах, осадке и мицелии определяли антимикробную активность методом дисков.

Тест-объектами для оценки фунгицидной активности были штаммы патогенных мицелиаль-ных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans АТСС 2091, C. tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов — A. oryzae 1К, A. niger 2К, A.fumigatus 4К, A. tereus 4К, A. fisheri 3К, A.flavus7К (из коллекции НИИНА им. Г.Ф. Гаузе).

Спектр антибактериального действия изучали с использованием в качестве тест-культур штаммов грамположительных бактерий — Bacillus subti-lis АТСС 6633, B. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий — Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461 из коллекции НИИНА им. Г.Ф. Гаузе.

Тест-культуры B. subtilis АТСС 6633 и B. mycoides 537 выращивали на среде, приготовленной на бульоне Хоттингера в разведении 1 : 2 следующего состава (г/л): глюкоза — 10.0; NaCl — 2.0; агар — 20.0. E. coli ATCC 25922, M. luteus NCTC 8340, S. aureus FDA 209P, C. terrigena ATCC 8461 выращивали на МПА ("ЗАО НИЦФ", Россия), грибные тест-культуры — на среде Чапека. Использовали суточные культуры бактерий и пятисуточ-ные культуры грибов.

Бактерии выращивали в пробирках со скошенным питательным агаром, затем клетки суспендировали в физиологическом растворе до мутности 0.5 по стандарту McFarland (1.5 х 108 КОЕ/мл) и использовали в течение 15 мин. Бациллы, стафилококки и микрококки культивировали при 37°С, E. саЫ — при 42° С, B. сoagulans — при 55°С, патогенные микроскопические грибы и дрожжи выращивали при 37°С, условно-патогенные — 28°С. Инокуляцию культур на чашку осуществляли штрихами в 3-х направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси.

Фунгицидное и антибактериальное действие экстрактов штаммов оценивали с помощью стерильных бумажных дисков, смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях. Контролем служили стандартные диски с амфотерицином В ("НИИ Пастера", 40 мкг/мл) и ампициллином ("НИИ Пастера", 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур изучаемыми моноспоровыми штаммами гриба рода Trichаderma оценивали на 2 сут (для бактерий), и на 5—7 сут (для грибов). Полученные результаты интерпретировали следующим образом: 0 — активности нет; до 12 мм — слабая чувствительность; от 13 до 29 мм — средняя чувствительность; 30 мм и более — высокая чувствительность [14].

У наиболее активного продуцента антибиотиков из 42 протестированных штаммов изучали влияние состава среды и условий культивирования на биосинтез антибиотиков. Опыты проводили на жидких средах — Чапека, Сабуро и среде с 3 %-ным неохмеленным суслом. Культуры выращивали глубинным способом (на качалке 10 и 14 сут при 200 об./мин), комбинированным (5 и 7 сут на качалке, затем стационарно 5 и 7 сут) и поверхностным способом в течение 10 и 14 сут. Для экстрагирования активных фракций из культуральной жидкости использовали п-бута-нол и этилацетат, из мицелия — этанол.

Для фракционирования этилацетатного экстракта культуральной жидкости использовали комбинацию методов жидкостной хроматографии — прямофазной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной (ОФ-ВЭЖХ). В качестве сорбента для прямофазной хроматографии использовали силикагель, в качестве элюента — хлороформ с последующим увеличением процентного содержания метанола в хлороформе. Полученный этилацетатный экстракт (Кд) перерастворяли в этаноле и очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле Юе8е1§е1 60 (40—63 мкм); элюцию осуществляли органическими растворителями в следующей последовательности: хлороформ, хлороформ—метанол (50 : 1 ^ ^ 10 : 1), метанол. В полученных элюатах определяли антимикробную активность методом дисков на тест культуры грибов и бактерий. Активные элю-

аты упаривали в вакууме досуха и растворяли в 3 мл 60%-ного этанола. Биоавтографию антибиотических веществ осуществляли с тест-организмами B. subtilis АТСС 6633 и А. niger INA 00760.

Цитотоксическую активность фракций отобранного штамма оценивали на 2 линиях опухолевых клеток: Colo 357 — клетки панкреатической карциномы и Т3М4 — клетки рака печени. Для этого линии клеток культивировали в монослой-ных культурах во флаконах или планшетах на среде Дульбеко (DMEM , НПП "ПанЭко", Россия) в термостате при температуре 37 °С с подачей СО2. В среды добавляли фетальную бычью сыворотку — 8%, L-глютамин — 300 мкг/мл, ампици-лин/стрептомицин — 50 мкг/мл, 2-меркаптоэта-нол - 5х10Е-5М [15].

Для анализа цитотоксичности экстрактов куль-туральной жидкости и их активной фракции использовали тест с метил-триазолтетразолием (МТТ) ("Sigma", США). МТТ-тест используется для анализа цитотоксичности потенциальных противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-ди-метилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтерар

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»