ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 2, с. 215-223
УДК 546.57:544.77.032.1:615.28
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ СТАБИЛЬНЫХ НАНОЧАСТИЦ
СЕРЕБРА ЗАДАННОГО РАЗМЕРА
© 2013 г. Ю. П. Муха*, А. М. Еременко*, Н. П. Смирнова*, А. И. Михиенкова**, Г. И. Корчак**, В. Ф. Горчев***, А. Ю. Чунихин***
*Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко НАН Украины, 03164 Киев-164 *Институт гигиены и медицинской экологии им. А.М. Марзеева НАМН Украины, Киев-94, 02660 ***Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев-601, 01601
e-mail: annaerem@ukr.net Поступила в редакцию 10.09.2012 г.
Разработаны условия получения стабильных наночастиц серебра размером менее 10 нм при использовании бинарного стабилизатора поливинилпирролидон/додецилсульфат натрия в оптимальных соотношениях. Получены оптические спектры, исследована морфология и зависимость среднего размера наночастиц от количества использованного восстановителя. Коллоидные растворы нано-серебра проявляют высокую бактерицидную активность по отношению к штаммам Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, а также фунгицидную по отношению к Candida albicans. Механизм действия наноразмерного серебра на микробную клетку исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с применением флуоресцентной метки. Первый этап антимикробного воздействия на микроорганизмы — разрушение мембраны и проникновение наночастиц серебра внутрь клетки. Показано сохранение стабильности наночастиц и их антимикробного действия на протяжении двух лет.
Б01: 10.7868/80555109913020128
В связи с существенным повышением устойчивости микроорганизмов к действию медикаментов, прежде всего антибиотиков, в медицинской практике чрезвычайно актуален поиск других антибактериальных средств, в том числе получение препаратов на основе серебра. В небольших концентрациях (на уровне ПДК — 50 мкг/л) серебро безопасно для организма человека, но проявляет разрушительное действие по отношению к большинству бактерий и вирусов, поэтому уже много лет активно используется для обеззараживания воды и борьбы с инфекциями. К настоящему времени уникальные свойства серебра всесторонне изучены [1—5]. Применение серебра в виде наночастиц (НЧ) позволяет в сотни раз снизить его концентрацию по сравнению с ионной формой с сохранением всех антимикробных свойств [6—10]. Важной задачей является как разработка нетоксичных антимикробных препаратов на основе НЧ серебра, сохраняющих свои бактерицидные свойства и стабильность в течение длительного периода, так и выяснение механизмов антимикробного действия. Одной из основных проблем при получении НЧ Л§ является их нестабильность вследствие легкого окисления.
Цель работы — получение стабильных НЧ Л§ и характеристика их антимикробного действия с
длительным сохранением бактерицидной активности.
МЕТОДИКА
Реактивы и материалы. Для получения НЧ Ag использовали следующие вещества: нитрат серебра (AgNO3, "Мегск", Германия), додецилсульфат натрия (ДДС, "Sigma", "Aldrich", Германия), поливи-нилпирролидон (ПВП, марки ВФС 42-1491-85 с молекулярной массой 10000), тетрагидроборат натрия (NaBH4, "Fluka", Германия).
Получение НЧ серебра. НЧ серебра в коллоидном растворе получали путем химического восстановления из нитрата серебра в присутствии тетрагидробората натрия с применением ПАВ ДДС в мольном соотношении к металлу 15 : 1, или полимера ПВП в соотношении 1 : 1. Известно, что использование отдельно ПАВ или полимера для стабилизации НЧ Ag имеет свои недостатки — небольшой срок хранения, коагуляция и окисление НЧ, а также потеря активности. Нами использован бинарный стабилизатор на основе ДДС и ПВП [11, 12]. Для снижения токсичности коллоидных растворов серебра синтез проводили с уменьшенным количеством ДДС до 0.5 мг/л (уровень предельно допустимой концентрации, ПДК) и увеличенным для ПВП до 30 г/л (3%).
Методы исследования образцов. Спектры поглощения коллоидных растворов НЧ Ag регистрировали в УФ- и видимой области с помощью спектрофотометра Lambda 35 ("Perkin-Elmer", США) в кварцевых кюветах диаметром 10 мм.
Электронно-микроскопические изображения получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-100C ("JEOL", Япония) с ускоряющим напряжением 100 кВ. Для расчета распределения частиц по размерам использовали программу ImageJ (National Institutes of Health, NIH, США). Функцию распределения частиц по размерам изучали с помощью лазерного корреляционного спектрометра (ЛКС) "ZetaSizer-3" ("Malvern Instruments", Великобритания), оборудованного коррелятором Multi8 (computing correlator type 7032 ce, "Malvern Instruments", Великобритания). Принцип действия ЛКС основан на методе динамического рассеивания света. Данный метод позволяет определять коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости на основе анализа характеристического времени флуктуации интенсивности рассеянного света. Из коэффициента диффузии по формуле Стокса-Эйн-штейна рассчитывали гидродинамический диаметр наночастиц. Исследуемую суспензию в количестве 1 мл помещали в цилиндрическую оптическую стеклянную кювету диаметром 10 мм, которую вводили в термостатированную лунку лазерного корреляционного спектрометра. Регистрацию и статистическую обработку рассеянного от суспензии под углом 90° лазерного излучения проводили трижды в течение 300 с (использовался гелий-неоновый лазер ЛГН-111 мощностью 25 мВт и длиной волны 633 нм). Полученную автокорреляционную функцию обрабатывали с помощью стандартных компьютерных программ PCS-Size mode v 1.61.
Определение антимикробной активности НЧ серебра. Бактерицидную активность коллоидных растворов НЧ Ag, стабилизированых ДДС, ПВП и комплексом ДДС/ПВП, исследовали суспензионным методом согласно европейским нормативам [13, 14]. Концентрация серебра в растворе составляла 0.0016%. Количество стабилизаторов варьировали: ДДС — от 0.065 до 0.000045% ( ПДК - 0.5 мг/л), ПВП - от 0.18 до 3.0%. В контрольном эксперименте исследовали растворы нитрата серебра и стабилизаторов в присутствии восстановителя.
Для определения бактерицидной активности были использованы штаммы Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli K12 NCTC 10538 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, а также Candida albicans ATCC 10231 — для определения фун-гицидной активности. Результаты оценивали по логарифму уменьшения количества жизнеспособных организмов после воздействия исследуе-
мого образца по сравнению с их начальным количеством lgR = lg^Q — lg^a, где R — коэффициент редукции. Высокую антимикробную активность образца определяли как уменьшение числа бактерий на 5.Q lgR и грибов на 4.Q lgR, что соответствует величине необходимой редукции в соответствии с европейскими стандартами (lgR > 90.0%) [13, 14].
Суть статистической обработки полученных данных заключалась в том, что опыты по определению бактерицидной/фунгицидной активности имели точность определения ±1.0 lg с 90.0%-ной вероятностью, если результат повторялся как минимум 3 раза. Среднее значение результатов повторов должно демонстрировать уменьшение количества микроорганизмов, которое требуется для данного вида исследования.
Изучение процесса взаимодействия НЧ с микробной клеткой. Взаимодействие НЧ с клетками C. albicans исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 META ("Carl Zeiss", Германия) в мультитрековом режиме работы. Для обоих каналов использовали объектив LD Plan-Neofluar 63х/0.75 Korr. В первом канале изображения клеток с НЧ получали в отраженном от поверхности образца свете. При этом использовался лазер с длиной волны 543 нм. Далее в канале располагались светоделитель MBS NT 80/20 и светофильтр LP 505. Второй канал регистрировал флуоресценцию образца, при этом для возбуждения флуоресценции использовалось лазерное излучение с длиной волны 405 нм, при этом в канале размещали светоделитель MBS HFT 405/488 и светофильтр LP505. Такая оптическая конфигурация микроскопа позволяла получать изображение клеток в отраженном свете, их флуоресцентное изображение и накладывать эти изображения одно на другое. Метка наночастиц — флуоресцеин вводился в экспериментальную смесь вместе с коллоидным раствором НЧ Ag при 1000-кратном молярном избытке металла.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве агентов, обычно используемых для стабилизации и предупреждения агрегации НЧ в коллоидных растворах, могут выступать ПАВ. В работе в качестве базового стабилизатора НЧ Ag в растворе использовали анионное ПАВ ДДС с критической концентрацией мицеллообразова-ния 8 ммоль/л. ДДС формирует сферические мицеллы с центральным гидрофобным ядром, радиус которого составляет 16.6 Á, и слоем, в котором размещены головные группы и противоионы (4.6 Á). Результаты исследования фонового рассеяния света от оболочки стабилизатора НЧ по методу ЛКС свидетельствуют о том, что стабилизаторы ДДС и ПВП в используемых в эксперименте концентра-
%
40 30 20 10
30 20 10
40 30 20 10
%
(а)
(б)
А 1.2
5 10 50100
5 10 50100 ё, нм
Рис. 1. Зависимость размера НЧ Ag от количества использованного восстановителя, распределение по объему (а, в, д) и по количеству НЧ (б, г, е), при молярном отношении №ВН4 : Ag = 1 : 1 (а, б), 5 : 1 (в, г), 25 : 1 (д, е). Количество кривых соответствует количеству повторов измерения.
циях не рассеивают свет, и, следовательно, не влияют на определение размера сформированных металлических наночастиц.
Нитрат серебра — наиболее доступное, дешевое и из-за хорошей растворимости в воде наиболее удобное вещество для получения наночастиц. Решающую роль в получении НЧ определенного размера играет количество восстановителя. С увеличением концентрации №ВН4 средний размер наночастиц уменьшался (рис. 1). В ряду молярных отношений №ВН4 : Ag увеличение количества восстановителя по сравнению с количеством серебра в 1, 5, 10, 25 раз приводило к уменьшению среднего размера НЧ до 20, 3, 2, 1 нм соответственно. Причиной этого может быть конкуренция зародышеобразования и роста зародышей при доминировании скорости первого процесса над вторым. Таким образом, изменяя количество №ВН4 по отношению к металлу, можно регулировать обр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.